338例少弱精、無(wú)精子癥患者ICSI助孕結(jié)局分析

劉 麗 曹曉敏 張暄琳 邸建永 徐鳳琴

天津市第一中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（天津 300192）

據(jù)資料統(tǒng)計(jì)在育齡夫婦中不孕不育夫婦約占15%，其中有30-50%為男方因素不育[1]。卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection ICSI）解決了多數(shù)男性不育問(wèn)題，對(duì)精子的數(shù)量、質(zhì)量要求均大為降低。理論上只要獲取一個(gè)活的精子，結(jié)合輔助生殖技術(shù)，就可能受精、妊娠。無(wú)精子癥患者通過(guò)外科手術(shù)取精并借助輔助生殖技術(shù)可以擁有自己的遺傳學(xué)后代。梗阻性無(wú)精子癥（obstructive azoospermia OA）患者可通過(guò)經(jīng)皮附睪穿刺取精術(shù) （percutaneous epididymal sperm aspiration PESA）、非梗阻性無(wú)精子癥患者 （non-obstructive azoospermia NOA）通過(guò)睪丸精子抽吸術(shù)（testicular sperm aspiration TESA）獲取精子[2]，但部分患者通過(guò)TESA仍不能獲得精子，隨著男科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，睪丸切開(kāi)顯微取精術(shù) （microdissection testicular sperm extraction MD-TESE）日漸普及，目前MD-TESE結(jié)合ICSI已經(jīng)成為治療NOA的金標(biāo)準(zhǔn)。為此類(lèi)患者帶來(lái)生育自己后代的希望，由于不同來(lái)源精子的發(fā)育成熟過(guò)程及成熟度均不相同，文獻(xiàn)對(duì)射出精子、附睪穿刺精子及睪丸穿刺精子的助孕結(jié)局報(bào)道不一[3,4]，MD-TESE與少弱精子組、重度少弱精子組、PESA、TESA行ICSI的臨床結(jié)局的報(bào)道較少。本結(jié)果選擇單純男方因素不孕而行ICSI助孕治療患者作為分析對(duì)象，旨在為臨床治療提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象及分組

回顧性分析2015年1月至2019年11月在我院生殖醫(yī)學(xué)科接受ICSI治療共338周期。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）夫妻雙方染色體均正常；（2）女方年齡≤38歲，月經(jīng)周期規(guī)律，基礎(chǔ)FSH＜15mU/mL）；（3）男方因素不孕。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）早補(bǔ)救 ICSI，晚補(bǔ)救 ICSI，前次 IVF 受精失敗行ICSI（2）女方子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥等；依據(jù)精子質(zhì)量分為少弱精子組167例、重度少弱精子組92例，無(wú)精子癥分為PESA組33例，TESA組24例，MD-TESE組22例。本研究獲天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)2019N069KY)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

（一）促排卵方案及取卵

采用常規(guī)長(zhǎng)方案、短方案或拮抗劑方案控制行卵巢刺激，當(dāng)至少有2個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)到17mm，肌注絨毛膜促性腺激素5000-10000IU，36小時(shí)后在B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道后穹隆穿刺取卵。卵子培養(yǎng)3h，透明質(zhì)酸酶消化去除卵冠丘復(fù)合物外的顆粒細(xì)胞，排出第一極體的成熟卵子（MII）待行ICSI。

（二）精子獲取及處理

常規(guī)射精：患者禁欲2～7天，取卵當(dāng)日采用手淫方法留取精液標(biāo)本，應(yīng)用密度梯度離心法或直接離心法處理精液，收集活動(dòng)精子待行ICSI。少弱精子癥和重度少弱精子癥診斷標(biāo)準(zhǔn)參考WHO人類(lèi)精液檢查與實(shí)驗(yàn)室處理手冊(cè)(第5版)，即男方3次精液常規(guī)檢查至少2次符合以下任一標(biāo)準(zhǔn)：1.精子濃度<15×106/ml；2.前向運(yùn)動(dòng)精子百分率<32%；重度少弱精子癥：1.精子濃度<5×106／ml；2.前向運(yùn)動(dòng)精子百分率 <10%；

MD-TESE及TESA：將獲取的睪丸組織置于解剖顯微鏡下，用兩支1ml注射針?biāo)核椴G丸組織，去除黏附的血塊、雜質(zhì)，劃破并擠壓曲細(xì)精管，使精子被分離出來(lái)，在倒置顯微鏡下檢測(cè)有無(wú)精子。若有精子，收集含精子的洗滌液，室溫孵育40-60min，待大塊組織沉淀，吸取上層液離心1000rpm 10min，行直接離心法處理，精子懸液放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育待行ICSI。

PESA：患者經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)，取出附睪液體，倒置顯微鏡下鏡檢有無(wú)活動(dòng)精子，有活動(dòng)精子行直接離心法處理，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育待行ICSI。

（三）受精、胚胎評(píng)估

常規(guī)行ICSI受精，16-18h觀察原核，雙原核和兩個(gè)極體為正常受精。

（四）胚胎移植

根據(jù)卵裂球的數(shù)目，均一性及碎片比例評(píng)分，第三天7-9細(xì)胞I-II級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。選擇1-2個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎移植，冷凍1-2個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎，剩余胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。

（五）妊娠判定及觀察指標(biāo)

移植14天后行尿、血絨毛膜促性腺激素測(cè)定確定是否妊娠，移植后28天陰道B超檢查，見(jiàn)孕囊及心血管搏動(dòng)為臨床妊娠。

（六）觀察指標(biāo)

2PN受精率=D1 2PN數(shù)/MⅡ卵子數(shù)；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)卵裂胚胎總數(shù)/2PN卵裂胚胎數(shù)；可利用胚胎率=移植胚胎數(shù)+冷凍胚胎數(shù)/2PN卵裂胚胎數(shù)；囊胚形成率=2期及2期以上囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎數(shù)；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)／移植周期數(shù)×100%；種植率=B超下見(jiàn)孕囊數(shù)／移植胚胎數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=妊娠12周流產(chǎn)的周期數(shù)／臨床妊娠周期數(shù)×100%；

（七）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD),組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。分類(lèi)變量以率(%)表示，組間比較采用X2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組患者臨床基礎(chǔ)資料比較

五組患者男、女方年齡、女方抗繆勒氏管激素水平、體質(zhì)量指數(shù)BMI、基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）、促性腺激素（Gn）使用天數(shù)、Gn總量、移植前內(nèi)膜厚度、平均獲卵數(shù)、MII卵數(shù)、平均移植胚胎數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）見(jiàn)表 1。

表1 五組患者臨床基礎(chǔ)資料

二、五組患者臨床結(jié)局比較

MD-TESE組與其他四組相比，2PN受精率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），少弱精子、重度少弱精子、PESA、TESA組2PN受精率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；各組間優(yōu)質(zhì)胚胎率、可利用胚胎率、囊胚形成率、早期流產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；重度少弱精子組臨床妊娠率、種植率低于其他四組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 2。

表2 五組患者臨床結(jié)局比較

討 論

1992年ICSI技術(shù)[5]的應(yīng)用使精液質(zhì)量差及無(wú)精子癥的患者均可通過(guò)ICSI獲得妊娠，射精獲得精子和通過(guò)手術(shù)從附睪或睪丸獲得精子相比較，理論上其核成熟度、精子運(yùn)動(dòng)能力及膜表面蛋白分子存在差異，不同來(lái)源的精子是否影響胚胎發(fā)育及臨床妊娠結(jié)局備受關(guān)注。

本研究少弱精子、重度少弱精子、PESA、TESA組相比2PN受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可利用胚胎率、囊胚形成率、早期流產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。馮翠娥等[6]比較射出精子組、附睪穿刺精子組及睪丸精子組的受精率、臨床妊娠率和早期流產(chǎn)率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符[7]。精子從產(chǎn)生到排出體外，在體內(nèi)經(jīng)歷了睪丸和附睪內(nèi)的一系列成熟過(guò)程，附睪是精子成熟的主要場(chǎng)所，包括精子核的成熟、頂體外膜抗原分布改變以及精子質(zhì)膜通透性改變等，最終才能使精子獲得運(yùn)動(dòng)能力及受精能力。ICSI避開(kāi)了常規(guī)受精過(guò)程中精子獲能、精子與卵子透明帶識(shí)別黏附、頂體反應(yīng)、精子與卵胞膜融合等步驟，人為選擇單一精子直接注射入卵胞漿內(nèi)完成受精，PESA組患者不孕原因多為輸精管梗阻，自身生精功能無(wú)明顯異常。睪丸精子成熟率低、密度少、活動(dòng)力差，但不影響其所形成胚胎的發(fā)育潛能，選用形態(tài)正常的活動(dòng)精子借助ICSI，仍然可以獲得高的受精率、種植率、臨床妊娠率。

重度少弱精子組的臨床妊娠率、種植率低于其他四組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由于重度少弱精子患者睪丸生精功能低下或障礙或基因缺陷、陰囊血運(yùn)異常、內(nèi)分泌紊亂或免疫因素引起的精子生成過(guò)程異常，表現(xiàn)為嚴(yán)重的精子數(shù)量、活動(dòng)力、形態(tài)及遺傳物質(zhì)異常，造成精子數(shù)目過(guò)少、活力差，且精液中包含大量白細(xì)胞、受損精子及未成熟精子，使精液中活性氧水平大大增高，極易誘發(fā)氧化應(yīng)激[8]，導(dǎo)致精子DNA碎片率增高，精子功能降低[9]，妊娠率下降。Gharagozloo等[10]報(bào)道也認(rèn)為，從氧化應(yīng)激反面方面來(lái)考慮，嚴(yán)重少、弱精子癥患者精液中由于未成熟精子、損傷精子、形態(tài)異常精子及過(guò)量白細(xì)胞等的存在而導(dǎo)致精液中活性氧水平增加并引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的精子損傷影響受精后的胚胎發(fā)育能力。

非梗阻性無(wú)精子癥約占無(wú)精子癥人群的60%[11]，是男性不育中最嚴(yán)重的一種疾病，是由于各種原因?qū)е碌牟G丸生精功能衰竭，精子發(fā)生障礙[12]，傳統(tǒng)TESA只是隨機(jī)獲取部分睪丸組織或生精小管，未獲精的患者只能依靠供精。近年研究顯示睪丸精子發(fā)生是局灶性和不均一的，即使睪丸大部分生精小管內(nèi)未找到精子，并不能排除小部分生精小管內(nèi)存在精子，由于NOA存在局灶性生精的理論基礎(chǔ)，MD-TESE在顯微鏡下操作，可以直接辨別可能含有精子的白色不透明的生精小管，更具有針對(duì)性。NOA患者通過(guò)MD-TESE成功獲得精子概率為20%～60%[13]，比TESA有更好獲精率和更少的術(shù)后并發(fā)癥[14，15]。MD-TESE結(jié)合ICSI使這些患者能有自己的生物學(xué)后代[16，17]。MD-TESE與其他來(lái)源精子ICSI結(jié)局比較鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究MD-TESE組2pn受精率73.02%，低于其他四組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這是由于顯微取精局部生精小管中獲精與TESA患者相比，睪丸生精能力更差，取出的精子極少，畸形率高，成熟精子比例較低，影響卵子激活，從而影響正常受精。Hatsuki等[18]報(bào)道顯微取精受精率73.5%，我們的結(jié)果與報(bào)道一致。MD-TESE組與其他組比較雖然受精率較低但優(yōu)質(zhì)胚胎率、可利用胚胎率、囊胚形成率、臨床妊娠率、種植率、早期流產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明睪丸精子已經(jīng)完成減數(shù)分裂，成為已攜帶父源遺傳物質(zhì)的單倍體和受精卵形成必需的中心粒，具備了使卵子受精后進(jìn)一步卵裂、發(fā)育形成正常胚胎的能力。劉貴華等[19]比較了顯微取精和重度少精子癥患者種植率和臨床妊娠率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。孫建華[20]報(bào)道ICSI周期MD-TESE的NOA患者和睪丸穿刺取精術(shù)的OA患者的優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率，流產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明不同來(lái)源的精子受精之后的胚胎發(fā)育潛能相似。

綜上所述，少弱精子、重度少弱精子及PESA、TESA、MD-TESE結(jié)合ICSI均可作為男方不育患者的助孕手段，單純男方因素不育患者無(wú)論是來(lái)源于睪丸、附睪，還是嚴(yán)重少弱精子癥患者射出的精子行ICSI，對(duì)妊娠結(jié)局無(wú)明顯影響。只要能獲得一定數(shù)量和質(zhì)量較好的可移植胚胎，均可獲得滿意的臨床妊娠結(jié)局。此外由于本研究樣本量小，數(shù)據(jù)僅限于胚胎植入后的臨床妊娠、胚胎早期發(fā)育，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量隨訪胎兒發(fā)育及出生結(jié)局。