三七治療阿爾茨海默病的網絡藥理學分析

孫天賜，李 雯，王登川 （廣東省深圳市龍華區中心醫院，廣東醫科大學附屬深圳龍華區中心醫院，廣東深圳 518110）

阿爾茨海默病(AD)是目前老年人死亡的第五大病因[1]，現有研究認為遺傳、環境、代謝等多種因素共同作用是其發生的原因[2]。其發病機制包括β淀粉樣蛋白的沉積[3]、 tau蛋白異常過度磷酸化[4-5]、膽堿能損傷、興奮性氨基酸毒性和免疫炎癥反應等等[6-8]。然而，除膽堿酯酶抑制劑以及非競爭性N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑(美金剛)外，仍無公認的臨床新型抗阿爾茨海默病藥物[2]。近年的研究表明，傳統中藥三七對阿爾茨海默病具有良好的療效，但缺乏系統分析和機制的研究。因此，本研究選用網絡藥理學方法，基于系統生物學的角度研究三七防治AD的作用機理，為三七防治AD提供研究基礎，并為進一步實驗驗證提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 三七所含化學成分的收集與整理

利用BATMAN-TCM(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of TCM, http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php)，以SAN QI為檢 索詞，檢索三七的化學成分。

1.2 預測靶標基因

利用BATMAN-TCM，以≥20分、P＜0.05為標準，篩選AD相關靶基因。

1.3 蛋白質互作(PPI)網絡的構建及核心基因分析

為探索靶點蛋白之間的相互作用，把三七治療AD的相關作用靶點上傳至STRING(https://stringdb.org/)，以置信度confidence score ＞0.4為參數構建PPI網絡圖。利用Cytoscape對網絡進行拓撲分析，根據“中介中心性”(betweenness)降序排列，篩選核心基因。

1.4 靶點-成分網絡構建及分析

根據靶基因和有效成分的預測結果，使用Cytoscape軟件將篩選出的有效成分、潛在靶點構建一個藥物-靶點網絡。在生成的網絡中，節點代表化合物、蛋白質，線代表化合物-靶點相互作用。

1.5 GO生物過程與KEGG通路富集分析

將三七治療AD的相關作用靶點上傳至在線KOBAS3.0數據庫(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)，分析靶點的GO生物過程與KEGG通路。

2 結果

2.1 三七治療AD的靶點

三七治療AD的靶標篩選檢索BATMAN-TCM數據庫發現三七治療AD的靶點共14個，與AD的經典通路基本吻合(P＜0.05)，見表1。

2.2 三七治療AD的靶成分

三七活性成分篩選通過BATMAN-TCM數據庫中整理出三七中共75個化合物，手動篩選三七治療AD的靶點對應的成分共32個，見表2。

2.3 PPI網絡的構建及核心基因分析

為了更好地清楚三七治療AD的作用機制，利用STRING軟件構建了三七治療AD相關靶點的PPI網絡，結果見圖1。PPI網絡中包含14個蛋白質節點，47條相互作用關系(連線)，其中3個蛋白質節點無相互作用關系。利用Cytoscape對網絡進行拓撲分析，根據“中介中心性”(betweenness)降序排列，篩選前5位核心基因為乙酰膽堿酯酶(AChE)、α7神經元尼古丁乙酰膽堿受體(CHRNA7)、毒蕈堿型膽堿受體M2(CHRM2)、絲氨酸水酶丁膽堿酯酶(BCHE)、脂蛋白E(APOE)。

2.4 靶點-成分網絡構建及分析

使用Cytoscape軟件構建在治療AD方面三七活性成分-作用靶點的網絡模型，見圖2。從圖2中可以看出，32個主要活性成分的14個潛在靶點對比到AD上，且不同的活性成分可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，充分體現了三七多成分、多靶點的作用機制。其中與靶點相互作用關系最緊密(連線條數為4條)的有Ditertbutyl Phthalate(鄰苯二甲酸二叔丁酯)、1,22-Docosanediol(1,22-二十二碳二醇)、(-)-Dicentrine(左旋荷包牡丹堿)、1-Tetradecanol(1-十四醇)、1-Heptadecanol(1-十七烷醇)和N-Nonanol(1-壬醇)。

2.5 GO和KEGG通路分析

進行GO分析，得到的候選靶標具有的功能信息1 586條(P＜0.05)，按P值選取前10條(表3)，結果發現其功能多涉及膽堿能和突觸傳遞、β-淀粉樣結合、突觸信號傳遞、跨突觸信號傳遞、順行跨突觸信號、化學性突觸傳遞、銨離子結合、乙酰膽堿結合等方面。以P＜0.05進行篩選，得到30條信號通路(如圖3)，其中排名前20的通路分別為膽堿能突觸、神經活性配體-受體相互作用、尼古丁成癮、鈣信號通路、化學致癌、AD、肌動蛋白細胞骨架的調節、PI3k-Akt信號通路、癌癥、代謝途徑、凋亡、色氨酸代謝、藥物代謝、內分泌和其他因素調節的鈣再吸收、卵巢類固醇生成、脂肪細胞脂解的調節、VEGF信號通路、花生四烯酸代謝、利什曼病、補體與凝血級聯。其中膽堿能突觸、神經活性配體-受體相互作用兩個途徑均有5個三七相關的靶基因富集。

表1 三七治療AD的靶點(≥20分)

表2 三七治療AD的靶成分

圖1 三七治療AD靶點蛋白的相互作用網絡

圖2 三七治療AD的靶點-成分網絡關系圖

3 討論

AD是一種慢性的中樞神經系統退行性疾病，是老年期癡呆最常見的一種類型，早期癥狀表現為短期記憶喪失、失語、方向感下降，病程呈慢性進行性，隨著疾病的發展，將嚴重影響社交、職業與生活功能，直至死亡[9-10]。據世界衛生組織(WHO)估計，全球65歲以上老年人群AD患病率為4%～7%。平均年齡每增加6.1歲，患病率升高1倍，85歲以后患病率可高達20%～30%[3]。數據顯示，我國AD患病人數達500萬，60歲人群中患病率為5%，80歲為20%[11]。目前關于AD的病因和發病機制尚未完全闡明，也無特效治療方法可以逆轉或阻止AD的病情發展，因此在傳統中醫藥中進行AD的研究，也是解決AD治療的重要途徑。

表3 三七治療AD的靶基因的GO分析

圖3 KEGG數據庫通路富集結果

AD在中醫學上屬于“呆病”范疇，在古代便有明代《景岳全書·癲狂癡呆》和清代陳士鐸《石室秘錄·呆病》分別以“速扶正氣為主”和“治痰即治呆”作為治法及方劑[12]。在20世紀初，“啟動于腎虛，進展于痰瘀火，惡化于虛極毒盛”的病機假說和分期辨證施治方案的提出使得AD中醫診療進一步規范[13-14]。2018年，AD中醫診療聯合共識小組達成的專家共識：AD早期以腎虛為主，應以補腎為原則；中期痰瘀火并現，應化痰、祛瘀、瀉火交替或并行；晚期因痰、瘀、火日久而化生毒濁所致，虛極毒盛，形神衰敗，需補腎固元，解毒化濁[12]。傳統中藥如三七、枸杞子、何首烏、巴戟天等有效成分能夠通過抗衰老、提高機體免疫、減輕神經元損傷等作用改善老年癡呆動物相關癥狀[15]。

三七始載于《本草綱目》，具有散瘀止血、消腫定痛之功效，兼具抗炎、保肝、抗腫瘤、鎮痛等作用。藥理學研究結果表明，三七具有抗凝血、心血管系統保護、腦組織和神經保護以及腎臟保護等作用[16]。三七的主要活性成分三七總皂苷能顯著提高老年大鼠的學習及記憶能力，減少海馬神經元凋亡[17]。臨床上應用針刺配合三七等藥物治療老年癡呆癥，有效改善腦萎縮，對于促進腦組織修復有一定作用[18]。三七皂苷具有改善學習記憶和治療AD方面的良好作用，作用機制主要涉及調節神經可塑性、調節β淀粉樣蛋白Aβ代謝、抗細胞凋亡、抗氧自由基損傷、抗炎癥、改善膽堿能神經系統功能等方面[19]。

盡管前期臨床實踐及實驗研究表明，三七對AD具有良好的療效，但缺乏系統分析和機制的研究。因為中藥成分的多樣性，加之與人體相互作用的復雜性，進行中藥治療疾病的潛在分子機制比較困難，但系統生物學和生物信息學的發展也為明確中藥治療疾病的機制提供了可能性[20]。網絡藥理學正是這樣一門基于系統生物學和多向藥理學，利用生物分子網絡分析方法，選取特定節點進行新藥設計和靶點分析的藥理學分支學科[21-22]。中藥治療疾病往往是通過多條信號通路組成了復雜的信號網絡，網絡藥理學正是以“多基因、多靶點”的特點契合復雜疾病的治療理念，即通過闡述藥物-靶點-基因-疾病之間的復雜網絡關系，進行新藥研發和藥物作用機制研究。系統生物學的研究能直觀地揭示藥物發揮的網絡結構，基于網絡藥理學的研究為明確中藥和中藥復方治療疾病機制提供了可能性[20]。

本研究分析結果顯示，三七治療AD的作用靶點共14個，通過網絡進行拓撲分析，前5位核心靶點為ACHE、CHRNA7、CHRM2、BCHE、APOE。靶點-成分網絡構建及分析結果顯示，32個主要活性成分的14個潛在靶點對比到AD上，且不同的活性成分可作用于相同的靶點，亦可作用于不同的靶點，充分體現了三七多成分、多靶點的作用機制。GO分析顯示，靶基因主要涉及膽堿能和突觸傳遞、β-淀粉樣結合等功能。KEGG通路分析顯示，靶基因主要與膽堿能突觸、神經活性配體-受體相互作用等通路相關。

通過三七有效成分篩選的5個AD核心靶點也確實在AD的發生發展和治療過程中發揮重要作用。海馬體和大腦皮層區域的乙酰膽堿(ACh)的水平對AD有直接影響，設計和合成廣泛的乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEIs)來控制ACh大腦的水平是治療AD的重要策略[23]。CHRNA7基因與多種認知缺陷疾病如精神分裂癥、AD有遺傳聯系[24]。 Chee等[25]的研究表明，CHRM2基因與CHRM3基因中的SNP位點之間相互作用影響是誘發AD的風險。而BChE，像AChE一樣，共同調節神經遞質乙酰膽堿的代謝，是AD診斷和治療的靶點[26]。APOE是周圍和中樞神經系統的脂質載體，APOE基因的ε4等位基因是晚期AD最強的遺傳危險因素[27]。

目前人們通過靶點-成分網絡關系分析，篩選出6個與靶點關系最緊密的活性成分：鄰苯二甲酸二叔丁酯、1,22-二十二碳二醇、左旋荷包牡丹堿、1-十四醇、1-十七烷醇和1-壬醇，但尚未見與AD相關的文獻報道。左旋荷包牡丹堿具有抗實驗性心律失常作用[28]，對冠狀動脈平滑肌的收縮有顯著的拮抗作用[29]， 并能抑制乙酰膽堿酯酶[30]，可能作為三七中起抗AD作用的主要成分之一。三七的主要有效成分三七皂苷多見于AD的治療研究，在BATMAN-TCM數據庫中檢索發現其主要作用靶點為ATPA1，不是該系統中AD預測的主要靶基因。三七皂苷有可能通過調節ATPA1進而影響AD相關靶基因的表達，當然這需要進一步的實驗驗證。

KEGG通路分析結果顯示，三七有效成分與AD的靶基因主要與膽堿能突觸和神經活性配體-受體相互作用通路相關。膽堿能突觸是AD的重要機制已經得到公認[31]，神經活性配體-受體相互作用通路與AD之間的相互作用關系也與文獻報道相符[32]。

綜上所述，三七治療AD主要作用于ACHE、CHRNA7、CHRM2、BCHE、APOE等靶點，并通過膽堿能突觸、神經活性配體-受體相互作用等通路發揮作用。本文對活性成分進行分析篩選出6個與靶點最具相關性的成分，為AD的治療藥物分離純化提供了研究基礎。