苦參堿對非小細胞肺癌的放射增敏作用

徐祖敏，楊 俊，鄧于紅，賀紅桂，史華帝，左瑜芳 （廣東醫科大學附屬醫院腫瘤中心，廣東湛江 524001）

癌癥是全世界面臨的公共衛生問題之一[1]，而肺癌患者的死亡率位居所有癌癥之首[2]。大多數肺癌在確診時已為晚期，晚期肺癌5年總生存率＜5%[3]。目前，放療在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的治療中具有重要的作用，能夠改善腫瘤患者的預后[4]。但是由于放射抵抗，制約了其療效，亦是造成治療失敗的主要原因之一。因此，尋找新型抗腫瘤藥物及低毒高效的腫瘤放射增敏劑，提高放射線對NSCLC的療效是目前的研究熱點。苦參堿(C15H24N2O)屬于四環喹嗪啶類生物堿，是傳統中藥豆科植物苦參分離提純后的活性成分，有著廣泛的生物學活性，如鎮痛、控制血脂、抗感染、抗氧化和抗腫瘤等[5]。前期研究表明苦參堿對多種腫瘤具有抗腫瘤作用，包括鼻咽癌、甲狀腺癌、乳腺癌、肝細胞癌等[6-11]，但是苦參堿與放射治療聯合對NSCLC細胞的作用尚未見報道。本研究擬在體外實驗中探討苦參堿對NSCLC細胞的毒性作用，以及苦參堿聯合放療對NSCLC細胞放射敏感性的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

人非小細胞肺癌H1299、A549細胞株在37℃、5%CO2飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清(Biological Industries)、1%青霉素(哈藥集團)、1%鏈霉素(哈藥集團)的RMPI-1640培養基(Hyclone)進行培養、傳代以及開展后續細胞實驗。苦參堿購自上海笛柏化學品技術有限公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所，AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)購自碧云天生物公司，Phospho-Histone H2AX抗體購自Cell Signaling Technology，GAPDH 抗體購自碧云天生物公司。

1.2 射線照射

醫科達直線加速器 ，照射前由物理師制定放療計劃并交由技師進行操作。常溫下置于直線加速器(醫科達，瑞典)4MV X線按放療計劃單的不同劑量進行照射，源皮距(SSD)=100 cm，培養皿底部加1.5 cm厚等效組織補償膜。

1.3 CCK-8法檢測苦參堿對NSCLC細胞作用

取對數生長期的H1299和A549細胞接種于96孔培養板。培養箱培養24 h后，加入含不同藥物濃度的培養液(含1%FBS)100 μL/孔，使藥物最終質量濃度為0、0.25、0.5、1、2、4、8 g/L，每組藥物濃度至少3個復孔，繼續培養24、48、72 h后，分別加入含有10% CCK-8的無血清RMPI-1640培養基100 μL/孔，置于細胞培養箱內，孵育2 h后，用酶聯免疫檢測儀檢測450 nm處的OD值。細胞抑制率= 1-(OD加藥-OD空白對照) /(OD對照-OD空白對照)×100%。應用Graph Pad Prism 5.0軟件計算半數抑制濃度IC50。

1.4 平板克隆形成實驗

取對數生長期的H1299和A549細胞制備成單細胞懸液，細胞懸液平均密度為10個/μL，按100、200、400、800和1 600個/孔的密度梯度將細胞接種于6孔板，培養箱孵育24 h，分別設為放療組和苦參堿聯合放療組。于放療前24 h加入含0.5 g/L苦參堿的完全培養基(含10% FBS)，24 h后放療組和苦參堿聯合放療組給予不同劑量照射，劑量分別為0、2、4、6、8 Gy，繼續放入培養箱孵育12 h，隨后更換新鮮完全培養液。培養箱中繼續培養10 d，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養，然后固定、染色、計數。存活分數(SF)=受照射細胞的克隆形成率÷對照組細胞克隆形成率×100%，克隆形成率%=克隆數÷接種細胞數×100%。使用Graph Pad Prism 5.0軟件，以多靶單擊模型y=1-[1-exp(-k×x)]^N擬合細胞存活曲線，并計算放射增敏比(SER)。

1.5 蛋白免疫印跡檢測蛋白表達水平

取對數生長期的H1299和A549細胞制備單細胞懸液，按10×104個/皿細胞數接種至6 cm培養皿，分為對照組、苦參堿組、放療組、苦參堿聯合放療組，培養箱培養24 h后，更換含0.5 g/L苦參堿的完全培養液，培養24 h后以6 Gy劑量進行放療，細胞放療24 h后提取細胞總蛋白。定量上樣30 μg/泳道，采用10%，15% SDS-PAGE進行電泳，電壓為100 V，時間約120 min。將凝膠中蛋白轉至PVDF膜上，電流調節為300 mA，90 min。轉膜后置于含5% 脫脂奶粉封閉液中，常溫下搖床封閉1 h。封閉后，一抗濃度1:1 000，4 ℃冰箱孵育過夜。回收一抗，用新鮮配好的緩沖溶液洗膜3次，每次約10 min，然后用非同一種屬二抗濃度1:5 000～1:10 000，室溫搖床上孵育1 h，用新鮮配好的TBST洗膜3次，每次約10 min。用辣根過氧化物酶標記的HRP-ECL高靈敏度發光液于暗室中均勻地涂抹于膜的表面，X線膠片曝光，將膠片分別置于顯影液、定影液中約5 min，待膠片干燥后掃描膠片。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

取對數生長期的H1299和A549細胞制備成單細胞懸液，按10×104個細胞/孔接種于6孔板，分別設為對照組、苦參堿組、放療組、苦參堿聯合放療組，每組分別設3個復孔。培養箱中培養24 h后，相應的更換含0.5 g/L苦參堿的完全培養液，培養24 h后以6 Gy劑量進行放療，繼續培養24 h后收集各組細胞，用PBS洗滌3次，1 000 r/ min離心5 min，用100 μL的Binding Buffer工作液懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI混勻，隨后加入400 μL的Binding Buffer工作液，室溫，避光，孵育5～15 min，運用流式細胞儀檢測凋亡細胞比例，至少重復3次。

1.7 統計學處理

運用SPSS17.0 進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及q檢驗或Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 苦參堿對NSCLC細胞的影響

在0.25～8 g/L范圍內，H1299、A549的細胞存活率隨著作用濃度的增加及作用時間的延長而顯著降低(P＜0.01)，見圖1。

2.2 苦參堿聯合放療對NSCLC放射敏感性的影響

與單純放療相比，苦參堿聯合放療能夠明顯降低H1299和A549細胞克隆數，差異有統計學意義(P＜0.05或0.01)，詳見圖2。H1299和A549細胞的放射增敏比(SER值)分別是1.22和2.02，二者SER值均＞1，表明苦參堿可增強NSCLC放射敏感性。

2.3 苦參堿聯合放療對NSCLC細胞DNA雙鏈斷裂相關蛋白γ-H2AX的影響

苦參堿聯合放療組的γ-H2AX蛋白表達水平較苦參堿組和放療組顯著增加，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。

2.4 苦參堿聯合放療對NSCLC細胞凋亡的影響

H1299細胞中對照組、苦參堿組、放療組、苦參堿聯合放療組的細胞凋亡率分別是(5.60±0.60)%、(8.86±1.38)%、 (8.78±3.10)%、 (19.80±1.28)%；A549細胞中對照組、苦參堿組、放療組、苦參堿聯合放療組的細胞凋亡率分別是(6.32±1.51)%、(14.90±4.29)%、(13.23±3.12)%、(24.55±5.26)%。苦參堿聯合放療組的H1299和A549細胞凋亡率明顯高于其他3組(P＜0.01或0.05)。詳見圖4。

圖1 苦參堿對NSCLC細胞的影響

圖2 苦參堿聯合放療對NSCLC細胞放射敏感性的影響

圖3 苦參堿聯合放療對NSCLC細胞DNA雙鏈斷裂相關蛋白γ-H2AX的影響

3 討論

苦參堿有著廣泛的生物學活性，其抗腫瘤的作用越來越受到重視。我們的研究表明，苦參堿可抑制NSCLC細胞的增殖，與前期研究結果一致[12-16]。此外，苦參堿聯合放療組能夠顯著降低細胞的克隆數，效果優于放療組和苦參堿組，其在H1299、A549細胞中的放射增敏比分別為1.22和2.02，表明苦參堿可以增加NSCLC細胞的放射敏感性。

在肺癌的治療過程中超過一半的患者會用到放療作為治療的手段。放療可直接或間接導致腫瘤細胞DNA損傷，從而觸發DNA損傷修復信號，招募相關DNA損傷修復因子進行修復[17]。核心組蛋白(H2A)家族，其成員包括H2A1、H2A2、H2AZ、H2AX、H2ABbD、 macroH2AX1和 macroH2AX2。 H2AX作為其中一員，與放療關系最為密切。當放療引起DNA雙鏈斷裂時，組蛋白H2AX被迅速招募到斷裂部位，并磷酸化為γ-H2AX，啟動DNA修復。所以γ-H2AX是DNA雙鏈斷裂損傷的標志。DNA雙鏈斷裂損傷越多形成的γ-H2AX灶點數目也越多[18]。為了進一步闡明苦參堿聯合放療對NSCLC細胞DNA雙鏈斷裂以及對γ-H2AX蛋白表達的影響，本研究通過收集不同分組和不同時間點的細胞，檢測γ-H2AX蛋白表達的情況，結果發現苦參堿聯合放療組γ-H2AX表達水平較放療組和苦參堿組顯著增加，且放療后4 h γ-H2AX蛋白的表達較放療后1 h表達水平高，提示苦參堿聯合放療可增加DNA雙鏈的斷裂。

放療可以直接誘導照射細胞的凋亡或程序性細胞死亡，而且凋亡也是放射治療誘導細胞死亡的主要機制[19]。無論是苦參堿還是放射治療，都可以誘導NSCLC細胞的凋亡。為了進一步證實苦參堿聯合放療對肺癌細胞凋亡的影響，我們運用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡，結果發現當苦參堿單獨作用于NSCLC細胞時能夠誘導細胞的凋亡，且當其與放療聯合作用后，NSCLC細胞凋亡更明顯，提示苦參堿聯合放療可增強誘導NSCLC細胞的凋亡。

圖4 苦參堿聯合放療對NSCLC細胞凋亡的影響

綜上所述，苦參堿可通過增加DNA雙鏈的斷裂誘導NSCLC細胞的凋亡，進而增加放射線對NSCLC細胞的殺傷作用。苦參堿或可作為有效的放射增敏劑，可望為NSCLC的放射增敏治療提供新的選擇。