離子色譜-電感耦合等離子體質譜法測定香菇中5種硒形態

趙 彤 ,周慧敏 ,冮 潔

(1.大連市食品檢驗檢測院,大連 116630; 2.大連民族大學,大連 116600)

硒是人體必需的微量元素之一[1],具有清除體內自由基、抗衰老、抗癌防癌、拮抗重金屬毒性等生物學功能[2]。硒攝入不足可以引起心血管疾病、腫瘤、大骨節病、關節炎等[3],補硒可以預防相關疾病的發生。但無機硒毒性較大[4],日本、美國等發達國家早已禁止在食品中添加亞硒酸鈉等無機硒[5]。因此,僅測定硒總量已不能滿足該元素在生物體系中生理、毒理作用研究的需要,研究其形態對其品質評價具有更加重要的意義。

富硒香菇屬于功能性農產品,是富含硒的食物,具有特殊的營養價值,在全國多個區域有廣泛種植,富硒香菇中的硒富集主要來自培養基中的可溶性硒鹽,可溶性硒鹽通過植物根部被吸收,進入內循環系統的路徑,參與了蛋白質的合成,將無機硒轉換為有機硒,更適合人體吸收和利用。

測定硒的國家標準主要有GB 5009.93－2017《食品中硒的測定》、GB 1903.22－2016《食品安全國家標準 食品營養強化劑 富硒食用菌粉》。GB 5009.93－2017是對食品中總硒進行測定,不能對硒的形態進行測定,從而不能正確了解和評價香菇中硒的形態分布,以及對人體健康的作用;GB 1903.22－2016采用水磁力攪拌的方式提取樣品,無法有效提取樣品中多種形態的硒。目前尚無測定食品中硒形態的國家標準。本工作以蛋白酶E 和檸檬酸溶液為提取劑,采用恒溫水浴振蕩和超聲提取法作為前處理,香菇樣品溶液經離子色譜(IC)分離后,采用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)進行測定,方法簡單快速,可以同時測定香菇中亞硒酸根、硒酸根這2種無機硒和硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸等3種有機硒的含量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Aglient 7800型電感耦合等離子體質譜儀;Agilent 1260型液相色譜儀。

亞硒酸根[Se(Ⅳ)]、硒酸根[Se(Ⅵ)]標準儲備溶液:1 000 mg·L－1(以硒計)。

硒代蛋氨酸(Se Met)標準儲備溶液:5.0 mg·L－1(以硒計),稱取適量的硒代蛋氨酸標準品用水溶解,溶解過程中滴加2～3滴鹽酸。

甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代胱氨酸(SeCys2)標準儲備溶液:5.0 mg·L－1(以硒計),分別稱取適量的甲基硒代半胱氨酸標準品和硒代胱氨酸標準品用水溶解。

流動相:含1% (體積分數,下同)甲醇的5 mmol·L－1檸檬酸溶液(pH 5.0),稱取1.05 g檸檬酸溶于1 L 水中,用氨水調pH 至5.0,再加入10 mL甲醇,于水浴中超聲脫氣10 min,備用。

硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸標準品的純度均大于99%;氨水、檸檬酸、正己烷均為分析純;鹽酸為優級純;試驗用水為超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器工作條件

1)IC條件 Hamilton PRP X100陰離子交換柱(250 mm×4 mm)[6],保護柱(50 mm×4 mm);流量1.0 mL·min－1;進樣體積50μL。

2)ICP-MS條件 射頻功率1 550 W;采樣深度9 mm;采集質量數78;載氣流量0.7 L·min－1,輔助氣流量0.48 L·min－1;積分時間0.5 s。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理

香菇樣品來源于某富硒香菇種植試驗區,通過在培養基中添加不同含量的亞硒酸鹽而種植得到富硒香菇,包括對照空白樣品(不富硒的樣品),樣品經干燥研磨成粉后備用。

1.3.2 總硒的測定

稱取香菇粉末樣品約0.5 g置于消解罐中,加入5 mL硝酸和2 mL 過氧化氫進行微波消解。消解完成后在電熱板上趕酸至1 mL,然后轉移至50 mL的容量瓶中,用水稀釋至刻度,按ICP-MS條件進行測定,同時做空白試驗[7]。

1.3.3 硒形態測定

稱取香菇粉末樣品約0.5 g于刻度離心管中,加入20 mL水混勻,按照樣品與酶質量比10∶1加入蛋白酶E,混勻,置于37 ℃恒溫水浴中振蕩提取6 h后,加入50 mmol·L－1檸檬酸溶液2.5 mL,常溫超聲10 min,取出后用水定容至25.0 mL,于10 000 r·min－1轉速下離心10 min。收集上清液5 mL,加入正己烷1 mL 渦旋混合,收集水相過0.22μm 水膜后,按儀器工作條件進行測定。

1.3.4 其他提取試驗

稱取香菇粉末樣品約0.5 g于刻度離心管中,加入20 mL提取劑[提取劑分別為水、1%(體積分數,下同)硝酸溶液、1%(體積分數,下同)鹽酸溶液、5 mmol·L－1檸檬酸溶液],在常溫、37 ℃、60 ℃下超聲10 min,取出后用水定容至25.0 mL,于10 000 r·min－1轉速下離心10 min。收集上清液過0.22μm 水膜后,按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按儀器工作條件對20.0μg·L－1的5種硒形態混合標準溶液進行測定,其色譜圖見圖1。

2.2 流動相的選擇

磷酸鹽體系和檸檬酸體系是元素形態測定常用的流動相體系,采用磷酸鹽體系時由于受離子效應的影響,靈敏度明顯較采用檸檬酸體系時的靈敏度低。由于電感耦合等離子體質譜法對硒的響應相對比較低,靈敏度對測定至關重要,且檸檬酸為有機酸,在質譜上有明顯的增敏效應,因此試驗選擇流動相為檸檬酸體系。

圖1 5種硒形態混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 5 selenium species

試驗分別配制5,10,20 mmol·L－1的檸檬酸溶液,充分溶解后用氨水調節每種濃度檸檬酸溶液的pH 依次為4.0,5.0,6.0進行試驗。結果表明:檸檬酸溶液的濃度和pH 越高,分離度越差。試驗選擇檸檬酸溶液的濃度為5 mmol·L－1。5 mmol·L－1檸檬酸溶液的酸度對5種硒形態保留時間的影響見圖2,pH 為4.0時,硒酸根未出峰。

圖2 5 mmol·L－1檸檬酸溶液的酸度對5種硒形態保留時間的影響Fig.2 Effect of acidity of 5 mmol·L－1 citric acid solution on retention time of 5 selenium species

由圖2可知:pH 為5.0時,5種硒形態的保留時間均較好。試驗結果表明:pH 為5.0時,5種硒形態的峰形均較好。試驗選擇流動相為含1%甲醇的5 mmol·L－1檸檬酸溶液(pH 5.0),加入1%的甲醇可起到進一步增加靈敏度和降低柱壓的效果[7]。

2.3 提取方法的選擇

目前硒形態測定的前處理提取方法較多,有水提取法、酸提取法、堿提取法、有機溶劑提取法和酶提取法[8]。形態測定只有好的回收率是不夠的,還要有好的提取率,很多試驗采用了水作為提取劑,雖然獲得了較好的回收率,但對以蛋白形態結合的硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸提取率較低[7],總提取率不足30%。試驗考察了提取劑依次為水、1%硝酸溶液、1%鹽酸溶液、5 mmol·L－1檸檬酸溶液時在不同提取溫度(常溫、37 ℃、60 ℃)下對5種硒形態回收率的影響,結果見表1,超聲提取時間10 min。

表1 提取劑在不同提取溫度下對5種硒形態回收率的影響Tab.1 Effect of extractant on recovery of 5 selenium species at different extraction temperatures%

由表1可知:5種硒形態在5 mmol·L－1檸檬酸溶液中穩定性較好,5種硒形態的回收率均較高,其中無機硒的回收率大于76.0%,說明在超聲過程中5 mmol·L－1檸檬酸溶液更有效地維持了反應液中5種硒形態的穩定。在1%硝酸溶液和1%鹽酸溶液中硒代胱氨酸的回收率遠小于其他硒形態的回收率,說明在超聲提取的過程中酸度對硒代胱氨酸的穩定性影響較大。硒代胱氨酸中含有較容易被破壞的Se－Se鍵,溫度與超聲過程中的外力共同作用,會使其中部分硒代胱氨酸的Se－Se鍵發生斷裂,從而改變了部分硒代胱氨酸的結構狀態,因此1%硝酸溶液和1%鹽酸溶液提取不適合于硒的形態測定。試驗還發現:提取溫度高于60 ℃時,回收率會變差,提取溫度過高不利于硒的提取。試驗中加入50 mmol·L－1檸檬酸溶液2.5 mL(定容后檸檬酸濃度為5 mmol·L－1)常溫超聲10 min。

由于香菇中硒主要以硒蛋白形態存在,僅使用5 mmol·L－1檸檬酸溶液進行提取,提取率并不是很高。因此,試驗采用蛋白酶和檸檬酸溶液共同進行提取,且考察了蛋白酶依次為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、淀粉酶、蛋白酶K 和蛋白酶E 時對5種硒形態總提取率的影響,結果見表2。

由表2可知:使用蛋白酶E時,5種硒形態總提取率較好。試驗選擇蛋白酶E和檸檬酸溶液共同進行提取,所得提取率更高,改善了單一方式提取率較低的問題。最后采用正己烷去除油性雜質,凈化后也減少了色譜柱堵塞的問題。

表2 蛋白酶對5種硒形態總提取率的影響Tab.2 Effect of protease on total extraction rate of 5 selenium species

2.4 標準曲線和檢出限

分別移取適量的亞硒酸根、硒酸根、硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸標準儲備溶液用水稀釋混合得到5.00,10.0,20.0,50.0,100.0μg·L－1的5種硒形態混合標準溶液系列。

按儀器工作條件對5種硒形態混合標準溶液系列進行測定,以5種硒形態的質量濃度為橫坐標,對應的信號強度為縱坐標繪制標準曲線。5種硒形態的線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表3。

由于電感耦合等離子體質譜法對硒的響應相對較低,因此檢出限對方法至關重要,一般色譜的檢出限是按照3～10倍的基線噪聲來計算的,但往往這種檢出限在實際樣品分析中并不可靠。試驗采用的添加法,是在對照空白樣品中加入一定量的5種硒形態混合標準溶液,通過測定發現具有數理統計意義的數據后定為方法的檢出限,結果見表3。

表3 線性范圍、線性回歸方程、相關系數和檢出限Tab.3 Linearity ranges,linear regression equations,correlation coefficients and detection limits

2.5 回收試驗

按試驗方法對空白香菇樣品進行加標回收試驗,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表4。

由表4可知:回收率為81.8%～94.6%,RSD 為2.6%～7.1%。

2.6 樣品分析

按試驗方法對3個富硒香菇樣品進行分析,平行測定3次,結果見表5。

由表5可知:香菇對硒有明顯的富集作用,硒主要以硒代蛋氨酸形態存在,同時也有少量的亞硒酸根和其他形態硒存在。結果表明:香菇能夠將大部分無機硒(亞硒酸根)轉化為有機硒,相比其他富硒農產品(總硒質量分數通常小于0.05 mg·kg－1),香菇對硒的富集能力和有機轉化率明顯較高,可見食用富硒香菇能更有效地補充硒。本方法能夠將香菇中大部分硒提取出來,提取率在72.6%～76.8%之間,但仍有部分硒不能夠被提取或是以其他形態存在而不能被測定。

表4 回收試驗結果(n＝5)Tab.4 Results of test for recovery(n＝5)

本工作建立了離子色譜-電感耦合等離子體質譜法測定香菇中5種硒形態的分析方法,方法有較好回收率和提取率,可以在15 min內同時測定5種硒的形態。本方法的建立,為香菇中硒元素的來源、富集、轉換和遷移的深入研究提供了方法依據,對正確評價香菇中硒對人體的作用有著積極的意義。

表5 樣品分析結果Tab.5 Analytical results of the samples