氣相色譜-質譜法同時測定卷煙主流煙氣中15種酚類成分

宋凌勇 ,趙 琪 ,黃世杰 ,胡 超 ,周 蕓 ,李瑞麗 ,徐石磊?

(1.廣西中煙工業有限責任公司,南寧 530001; 2.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院,鄭州 450001)

美拉德反應是指氨基化合物和羰基化合物發生的一系列復雜反應[1-2],其產物即美拉德反應產物(MRPs)作為天然香料,加入卷煙中可形成對煙草香味有重要影響的吡嗪、吡咯類和吡喃酮類化合物,可以增強煙草香氣,在一定程度上解決了煙草減害增香之間的矛盾,同時具有一定的抗氧化活性和清除自由基的效果。因此,以美拉德反應為基礎的煙用原料開發正成為煙草行業的研究熱點[3-5]。

卷煙煙氣中酚類物質主要來源于煙葉中多酚類化合物的裂解,其對卷煙香氣質量具有重要影響,如2,6-二甲基苯酚具有甜味及增濃效果、丁香酚具有芳香和沉悶的效果,但引起人們更關注的是其對卷煙安全性的影響[6-8]。酚類物質對人的呼吸道和其他器官有不良的刺激作用,有些更被確認為致癌物和聯合致癌物[9-10]。

目前,酚類物質的測定主要采用氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質譜法等,但傳統的色譜法需要衍生化,前處理較繁瑣,液相色譜法價格較昂貴,普及率不高[11-13]。本工作建立了氣相色譜-質譜法(GC-MS)同時測定卷煙主流煙氣中15種酚類成分的分析方法,通過對比分析加香前后主流煙氣中酚類成分差異,為準確評價MRPs在卷煙中的加香效果及安全性提供理論支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B/5977A 型氣相色譜-質譜聯用儀;CIJECTOR 型自動注射加香儀;RM200 型轉盤式吸煙機;SB-3200DT 型超聲波清洗機。

內標溶液:0.100 0 g·L－1,稱取0.025 0 g乙酸苯乙酯,用乙酸乙酯定容至250.0 mL。

15 種酚類成分的混合標準儲備溶液:含2 590 mg·L－1苯酚、2 050 mg·L－1鄰甲酚、1 768 mg·L－1對、間甲酚、1 550 mg·L－1愈創木酚、1 396 mg·L－12,6-二甲基苯酚、1 990 mg·L－12,4-二甲基苯酚、1 216 mg·L－12,5-二甲基苯酚、1 060 mg·L－13,5-二甲基苯酚、966 mg·L－12,3-二甲基苯酚、2 420 mg·L－13,4-二甲基苯酚、950 mg·L－12,4,6-三甲基苯酚、690 mg·L－14-乙基愈創木酚、1 348 mg·L－14-乙烯基愈創木酚、920 mg·L－12,6-二甲氧基苯酚、1 872 mg·L－1丁香酚,稱取適量的15種酚類成分標準品于50 mL容量瓶中,用內標溶液定容,使用時用內標溶液稀釋至所需質量濃度。

果糖、脯氨酸、天冬氨酸、丙氨酸均為食品級;丙二醇、氨水均為分析純;二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、正己烷均為色譜純;15種酚類成分標準品和乙酸苯乙酯標準品的純度均不大于98%。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 HP-5MS 色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25μm);載氣為氦氣,流量1.0 mL·min－1;進樣口溫度280 ℃;分流進樣,分流比5∶1;進樣量1μL。柱升溫程序:初始溫度40 ℃;以10 ℃·min－1速率升溫至80 ℃;再以0.8 ℃·min－1速率升溫至140 ℃,保持5 min;最后以20 ℃·min－1速率升溫至250 ℃。

2)質譜條件 電子轟擊離子源(EI),電子電流70 e V;離子源溫度230℃,四極桿溫度150℃,傳輸線溫度280 ℃;選擇離子監測(SIM)模式。其余質譜參數見表1。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

1.3.1 MRPs的制備

根據前期試驗摸索與參考相關文獻[14-15],稱取18 g果糖、5 g脯氨酸、2.5 g天冬氨酸和1.25 g丙氨酸,加入100 mL的丙二醇為反應底液,用氨水調節其pH 為8.5。將上述反應底液加入到帶有攪拌子和回流冷凝管的三口燒瓶內,置于100 ℃的油浴中,反應3.5 h后取出,自然冷卻至室溫。

1.3.2 MRPs的加香試驗

以95%(體積分數)乙醇溶液為溶劑,將MRPs按質量分數1‰,2‰,4‰等3個添加水平注射到平衡好的空白卷煙樣品中。

1.3.3 卷煙主流煙氣中15種酚類成分的測定

將卷煙樣品及加香卷煙樣品置于溫度為(22±2)℃和相對濕度為(60±3)%的條件下平衡48 h,用劍橋濾片平衡12 h。按GB/T 19609－2004《卷煙用常規分析用吸煙機測定總粒相物和焦油》規定的方法抽吸卷煙,用直徑92 mm 的劍橋濾片捕集20支卷煙主流煙氣總粒相物。抽吸完畢后,將劍橋濾片轉移至150 mL 三角瓶中,加入35 mL 乙酸乙酯,超聲萃取30 min,過0.45μm 有機膜后轉移至色譜瓶中,按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 萃取方式的選擇

按試驗方法考察了超聲萃取和振蕩萃取這兩種萃取方式對15種酚類成分萃取效果的影響,結果見圖1。

圖1 萃取方式對15種酚類成分萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction method on extraction effect of 15 phenolic components

由圖1可知:超聲萃取對大部分酚類成分具有較好的萃取效果。試驗選擇萃取方式為超聲萃取。

2.2 萃取溶劑及其用量的選擇

按試驗方法考察了萃取溶劑依次為二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、正己烷時對15種酚類成分萃取效果的影響,結果見圖2。

圖2 萃取溶劑對15種酚類成分萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on extraction effect of 15 phenolic components

由圖2可知:乙酸乙酯對大部分酚類成分均有較好的萃取效果。為保證整體萃取效果,試驗選擇萃取溶劑為乙酸乙酯。

試驗進一步考察了乙酸乙酯用量對15種酚類成分萃取效果的影響,結果見圖3。

圖3 乙酸乙酯用量對15種酚類成分萃取效果的影響Fig.3 Effect of amount of ethyl acetate on extraction effect of 15 phenolic components

由圖3可知:隨著乙酸乙酯用量的增加,大部分酚類成分含量均先增加后趨于穩定;加入35 mL乙酸乙酯時15種酚類成分已基本萃取完全。試驗選擇乙酸乙酯用量為35 mL。

2.3 萃取時間的選擇

按試驗方法考察了萃取時間依次為10,20,30,40,50 min時對15種酚類成分萃取效果的影響,結果見圖4。

圖4 萃取時間對15種酚類成分萃取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction effect of 15 phenolic components

由圖4可知:隨著萃取時間的延長,15種酚類成分含量均呈現先增大再減小的趨勢,萃取時間為30 min,萃取效果最佳,這可能是因為隨著萃取時間延長,化合物結構被破壞[16]。試驗選擇萃取時間為30 min。

2.4 標準曲線和檢出限

按儀器工作條件對15種酚類成分的混合標準溶液系列進行測定,并繪制標準曲線。15種酚類成分的線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表2。

根據3 倍標準偏差計算方法的檢出限(3s),10倍標準偏差計算方法的測定下限(10s),結果見表2。

表2 線性范圍、線性回歸方程、相關系數、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity ranges,linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

表2 (續)

由表2可知:15種酚類成分的檢出限為0.14～2.12 mg·L－1,測定下限為0.46～7.07 mg·L－1,本方法具有較低的檢出限和測定下限。

2.5 精密度和回收試驗

按試驗方法對卷煙樣品進行分析,并在卷煙抽吸后的劍橋濾片上添加15種酚類成分的混合標準溶液進行加標回收試驗,平行測定5次,計算回收率和測定總量的相對標準偏差(RSD)。精密度和回收試驗結果見表3。

由表3可知:回收率為86.4%～105%,RSD 為1.4%～7.2%。利用此方法測定卷煙主流煙氣中15種酚類成分的含量具有很強的可靠性和準確性。

表3 精密度和回收試驗結果(n＝5)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

2.6 樣品分析

按試驗方法對卷煙樣品和3個添加水平的加香卷煙樣品進行酚類成分的對比分析,結果見表4。

由表4可知:隨著MRPs添加量的增加,主流煙氣中大部分酚類成分含量及總量均呈現降低趨勢。MRPs添加量為1‰時,酚類成分總量有所增加,可能與中間產物在抽吸過程的裂解有關[17],其中3,5-二甲基苯酚含量增加了12.78%,3,4-二甲基苯酚含量減少了33.34%;MRPs添加量為2‰和4‰時,酚類物質總量分別降低了1.26%和3.92%,大部分酚類成分均有明顯降低,這可能與MRPs的抗氧化活性及清除自由基作用有關[18]。

表4 樣品分析結果Tab.4 Analytical results of the samples

卷煙樣品的選擇離子流色譜圖見圖5。

圖5 卷煙樣品的選擇離子流色譜圖Fig.5 Selected ion current chromatogram of the sample of cigarette sample

按試驗方法和YC/T 255－2008《卷煙主流煙氣中主要酚類化合物的測定高效液相色譜法》中方法測定卷煙樣品及2‰添加量的加香卷煙樣品中苯酚、鄰甲酚和對、間甲酚的含量,結果見表5。

由表5可知,2種方法的測定結果一致。相比標準方法,本方法具有分析時間短、檢出限低等優點。

表5 本方法和標準方法測定結果的比較Tab.5 Comparison of the results of the method and the standard methodμg·支－1

本工作以添加MRPs前后的卷煙為研究對象,通過劍橋濾片捕集卷煙主流煙氣總粒相物,利用溶劑萃取的方法提取香味成分,采用氣相色譜-質譜法對15種酚類成分進行測定,并利用該方法對加入MRPs前后的卷煙主流煙氣中酚類成分進行對比分析。本方法精密度、準確度較好。隨著MRPs添加量的增加,主流煙氣中大部分酚類成分含量及總量均呈現降低趨勢,這在一定程度上可以提高卷煙安全性。