高效液相色譜法測定新鮮煙葉中3種多胺

黃麗佳 ,梁夢潔 ,李應郡 ,米其利 ,黃海濤 ,楊葉昆 ,楊光宇,李 晶?

(1.昆明醫(yī)科大學藥學院,昆明 650504; 2.天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300222;3.云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心,昆明 650106)

隨著煙草基因編輯工廠化育種工作的開展,抗旱抗寒等耐逆境的品種培育已提上日程[1],對產生的大量編輯素材,利用相應的代謝物進行篩選評價是一個可靠和有效的方法[2]。多胺是植物體內代謝過程中產生的一種低分子脂肪族含氮堿,具有生物活性,其作為一種重要的生長調節(jié)因子,參與適應逆境、成熟與衰老、延遲衰老等重要的生理過程[3]。多胺的測定,對于植物體逆境脅迫的響應過程和作用具有重要的研究價值和意義[4]。

近年來,多胺的測定方法得到了很大發(fā)展,主要有高效液相色譜法(HPLC)[5]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[6]、毛細管電泳-電化學發(fā)光檢測法(CE-CL)[7]、毛細管電泳-質譜法(CE-MS)[8]、離子色譜法(IC)[9]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[10-11]、薄層色譜法(TLC)[12]、頂空固相微萃取與離子遷移譜聯用(HS-SPME-IMS)[13]、生物傳感器串聯光學化學法[14-15]、酶聯免疫法(ELISA)[16-17]等。由于CECL、CE-MS、IC、GC-MS、HS-SPME-IMS 等方法操作復雜并且儀器昂貴,而使用紫外檢測器的高效液相色譜法操作簡單,能夠滿足煙草中多胺含量測定的需求[18],可用作煙草中多胺含量測定的手段。多胺本身不具有特征光譜吸收基團,衍生化方法不僅可以引入可測定的光譜基團,提高多胺測定靈敏度,而且可以增加多胺的非極性,改善分離度[19]。常見的衍生化試劑有鄰苯二醛(OPA)、丹磺酰氯、n-羥基琥珀酰亞胺酯(DMQC-Osu)、苯甲酰氯等[20-22],其中丹磺酰氯應用較為廣泛[23]。

當前并無現成的測定煙草中多胺的標準可以參考執(zhí)行,而煙草育種工作中植物體內多胺的測定需求迫在眉睫,本工作采用高效液相色譜法測定新鮮煙葉中腐胺、亞精胺、精胺等3種多胺的含量,擬對煙草植株中多胺的含量建立相應的測定方法,為煙草基因編輯育種的篩選和評價提供有效工具和數據支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀,配真空脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、恒溫柱箱、二極管陣列檢測器和工作站;Milli-Q50 型超純水儀;SJIA-50FE型冷凍干燥機;FW 80型小型粉碎機。

腐胺、亞精胺、精胺等3 種多胺的標準儲備溶液:1.00 g·L－1,分別稱取10.0 mg腐胺、亞精胺、精胺的標準品,用適量的0.1 mol·L－1鹽酸溶液溶解后轉移至10 mL棕色容量瓶中,用0.1 mol·L－1鹽酸溶液稀釋至刻度,于4 ℃下保存。使用時,用0.4 mol·L－1高氯酸溶液稀釋至所需質量濃度。

腐胺、亞精胺、精胺的純度均大于98%;乙腈為色譜純;乙酸銨為優(yōu)級純;其余試劑均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5μm),柱溫30 ℃;流量1.0 mL·min－1;進樣量10μL;測定波長254 nm。流動相:A 為0.01 mol·L－1乙酸銨溶液;B 為乙腈。梯度洗脫程序:0～20 min時,B 由50%升至95%,保持10 min;30～31 min時,B由95%降至50%,保持9 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品提取

5個煙苗樣品(B1～B5)由某煙草基因編輯育種工廠提供,為成苗期煙苗樣品;3個煙葉樣品(D1～D3)為正常煙葉樣品,由某煙草公司技術中心提供。

取新鮮煙葉樣品,經凍干機凍干,用粉碎機加工至粉末后分裝備用。

取粉末樣品200.0 mg置于10 mL 離心管中,加入0.4 mol·L－1高氯酸溶液5 mL 后,于超聲儀中提取40 min,以10 000 r·min－1轉速離心5 min,取上清液待用。

1.3.2 樣品衍生化

移取1 mL上清液至15 mL 離心管中,依次加入堿性反應介質(飽和碳酸氫鈉溶液,以氫氧化鈉調節(jié)pH 至12.0)800μL,4 g·L－1丹磺酰氯丙酮溶液1 mL,蓋塞密封。渦旋30 s后,于水浴鍋中恒溫40 ℃反應40 min,避光。反應完畢后,于通風櫥中加入200μL氨水,渦旋混勻,靜置30 min,加入乙腈2 mL 后,用水定容,渦旋1 min,以10 000 r·min－1轉速離心2 min,移取上清液,過0.45μm有機相微孔濾膜至色譜瓶中,按色譜條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按色譜條件對3 種多胺混合標準溶液進行測定,其色譜圖見圖1。

圖1 3種多胺混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 3 polyamines

由圖1可知:3種多胺在進樣后30 min內完全出峰,各色譜峰無拖尾、峰形對稱完整。

2.2 樣品衍生化條件的選擇

試驗采用正交試驗,考察了衍生化反應介質的酸度、衍生化反應時間和衍生化反應溫度等3個因素對3種多胺測定結果的影響。每個因素選取3個考察水平,正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 Factors and levels in orthogonal test

正交試驗以固定含量的腐胺、亞精胺和精胺的峰面積為優(yōu)選因子,正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Tab.2 Results of orthogonal test

表2 (續(xù))

由表2可知:對3種多胺測定結果影響最大的因素是衍生化反應溫度,其次為衍生化反應時間,最后為衍生化反應介質p H;通過優(yōu)化,得出的較優(yōu)方案為A3B2C1。由于A3,C1為邊界點,試驗還對優(yōu)化試驗進行了擴展,對A,C兩項進行了更多點的考察,根據所有試驗結果,最終仍選擇A3B2C1的試驗方案,該方案在各組試驗中均表現為較佳或者最佳。因此,試驗選擇的衍生化條件為:衍生化反應溫度為40 ℃,衍生化反應時間為40 min,衍生化反應介質的酸度為pH 12.0。

2.3 色譜條件的選擇

多胺是一種含有多個氨基的胺類化合物,極性較強,采用丹磺酰氯衍生化后,可弱化其極性。為了獲得更好的分離效果,通過改變流動相中水相比例或增加色譜柱長度來增強保留作用,可選用填料為十八烷基硅烷的色譜柱進行分離。試驗參考文獻[24]選用ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5μm)分離3種多胺。

腐胺、亞精胺和精胺的分離采用梯度洗脫,試驗比較了水-乙腈、乙酸銨-乙腈兩種體系的流動相,發(fā)現乙酸銨-乙腈體系作為流動相時,3種多胺的峰形尖銳、基線平穩(wěn),有利于3種多胺的分離和測定。試驗對比了乙腈和甲醇作為流動相的有機相時對3種多胺測定的影響。結果表明:乙腈作為流動相的有機相時,色譜圖中基線更為平穩(wěn),柱壓相對較低。試驗選擇流動相為乙酸銨-乙腈體系。

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

按色譜條件對0.50,1.00,5.00,10.0,20.0,50.0 mg·L－1的3 種多胺混合標準溶液系列進行測定,以3種多胺的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明:3種多胺的質量濃度均在0.50～50.0 mg·L－1內與其對應的峰面積呈線性關系,線性回歸方程和相關系數見表3。

根據3倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N),根據10倍信噪比計算方法的測定下限(10S/N),結果見表3。

表3 線性回歸方程、相關系數、檢出限和測定下限Tab.3 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

由表3可知:檢出限為0.07～0.08 mg·L－1,測定下限為0.23～0.28 mg·L－1。

2.5 精密度和回收試驗

按試驗方法對新鮮煙葉樣品進行分析,并進行加標回收試驗,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表4。

表4 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表4可知:回收率為86.4%～100%,RSD 為0.70%～4.4%。本方法測定新鮮煙葉中腐胺、亞精胺和精胺的準確度和精密度滿足分析要求。

2.6 樣品分析

按試驗方法對編輯素材成苗期煙苗樣品和正常煙葉樣品進行分析,結果見表5。

表5 樣品分析結果Tab.5 Analytical results of the samplesμg·g－1

由表5可知:B1～B5的編輯素材成苗期煙苗樣品主要用于耐寒、耐旱品種的選育,相較于正常煙葉樣品(D1～D3)來說,腐胺在編輯素材成苗期煙苗樣品中有一個明顯的大幅度的提升(部分達到20倍以上),亞精胺的變化幅度不是特別明顯,精胺也存在一個明顯的升高的趨勢。這在一定程度上表明:多胺在煙葉逆境脅迫的響應過程中具有一定的表征意義,可以作為耐寒、耐旱等逆境脅迫品種選育的一個數據支持,但是具體的影響因素和作用機理還需要后續(xù)的深入研究。

某編輯素材成苗期煙苗樣品的色譜圖見圖2。

圖2 樣品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of the sample

本工作建立了高效液相色譜法測定新鮮煙葉中腐胺、亞精胺及精胺等3種多胺的分析方法,本方法操作簡單、色譜分離度好、精密度與回收率均滿足測定要求。本方法表明:高效液相色譜法可用于新鮮煙葉中多胺的含量測定與監(jiān)測,可為逆境脅迫煙葉中多胺的測定提供可靠的分析方法。