高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定白酒中紫杉醇和三尖杉寧堿

(福建省食品藥品質量檢驗研究院,福州 350001)

紅豆杉為我國一級保護樹種,紅豆杉提取物紫杉醇具有獨特的抗腫瘤作用機制[1-3],是臨床應用中最為優(yōu)秀的天然抗腫瘤藥物[4-6]。但紅豆杉本身毒性很大,其莖、枝、葉、果、根均含毒性成分,有毒化合物包括紫杉堿、紫杉醇等。在沒有醫(yī)生的指導下,長期大量食用紅豆杉,將引起中毒,主要表現(xiàn)為頭昏、瞳孔放大、惡心、嘔吐、彌散性腹痛、肌無力等癥狀,嚴重者出現(xiàn)心率過緩、心臟驟停或死亡等[7-9]。《衛(wèi)生部關于進一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》(衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51號)[10]中,已將紅豆杉列入《保健食品禁用物品名單》,禁止紅豆杉作為保健食品和食品原料使用。2006年衛(wèi)生部發(fā)布第2號公告[11],嚴禁食品生產經營單位生產和經營含紅豆杉的食品。但由于紅豆杉的抗癌特性在民間有較高的知名度,市場上仍存在違法生產銷售以紅豆杉為原料的相關食品情況[12-13],最常見的是以紅豆杉果為原料,白酒為酒基,制作的所謂紅豆杉酒、紅豆杉保健酒,在一些網絡銷售平臺進行售賣。

目前我國還未建立任何食品中非法添加紅豆杉的測定方法和標準,致使市場監(jiān)管部門在查處相關案件時缺乏權威測定技術支持。本工作從確定紅豆杉在白酒中的特征成分入手,建立了高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定白酒中紅豆杉特征成分紫杉醇和三尖杉寧堿的方法,并應用所建立的方法對網售紅豆杉酒和市場上其他植物類保健酒、配制酒進行測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

API 4000Q 型高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀1(用于確定紅豆杉的特征成分);ACQUITY UPLC ICLASS/XEVO TQ-S型高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀2(用于定量分析);Milli-Q IQ 7000型純水系統(tǒng);CR 21N 型高速冷凍離心機。

紫杉醇和三尖杉寧堿標準儲備溶液:1 000 mg·L－1,分別稱取紫杉醇和三尖杉寧堿對照品約10 mg,用適量甲醇溶解,并用甲醇定容于10 mL容量瓶中,于4 ℃保存。

紫杉醇對照品的純度大于98.0%;三尖杉寧堿對照品的純度為97.0%;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純;試驗用水為純凈水。

1.2 儀器工作條件

1)質譜條件(用于確定紅豆杉的特征成分)電噴霧離子源(ESI),正離子模式;離子源溫度450 ℃;全掃描模式,掃描范圍質荷比(m/z)為100～500,500～1 000;電噴霧電壓4 500 V;氣簾氣壓力1.72×105Pa,霧化氣壓力3.79×105Pa,輔助氣壓力3.79×105Pa;分辨率2 000。

2)色譜條件(用于定量分析) ACQUITY UPLC R BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm),柱溫30 ℃;流量0.2 mL·min－1;進樣量1μL。流動相:A 為甲醇,B 為水。梯度洗脫程序:0～1.00 min時,A 為70%;1.00～3.00 min時,A 由70%升至90%,保持1.00 min;4.00～4.01 min時,A 由90%降至70%,保持1.99 min。

3)質譜條件(用于定量分析) 電噴霧離子源,正離子模式;離子源溫度150 ℃;毛細管電壓2.76 k V;脫溶劑氣溫度500 ℃,脫溶劑氣流量950 L·h－1;多反應監(jiān)測(MRM)模式。其余質譜參數(shù)見表1,其中,“?”為定量離子。

表1 質譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

1.3.1 紅豆杉果酒的制備

紅豆杉采自某鎮(zhèn)紅豆杉林(海拔800 m),摘下果子備用。白酒購于某超市。

將100 g紅豆杉果實(保持果實原有形狀)加入300 mL 53°白酒中放置于白酒原包裝瓶中,常溫保存3個月。

1.3.2 紅豆杉果酒中化學成分分析

取上述自制的紅豆杉果酒,用蠕動泵以流動注射方式注入高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀1的質譜儀中進行掃描。

通過得到的總離子流色譜圖選取可能含有的目標成分(紫杉醇和三尖杉寧堿)的母離子,再對母離子施加一定的碰撞電壓,使其產生特定的子離子,通過分析質譜碎片信息,確定含有的特征成分。

1.3.3 特征成分的測定

紅豆杉酒(紅豆杉果酒、紅豆杉樹皮酒)為自制和某網絡平臺購買,其他植物保健酒和植物配制酒來自市場抽檢樣品。

稱取2.00 g紅豆杉酒樣品于100 mL 容量瓶中,用70%(體積分數(shù),下同)甲醇溶液定容,搖勻,以8 000 r·min－1轉速離心10 min,取上清液注入高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀2,按儀器工作條件進行測定(定量分析)。

2 結果與討論

2.1 紅豆杉特征成分的選擇

根據(jù)文獻[14-16],從紅豆杉中可分離得到紫杉烷類、黃酮類等化合物,推測白酒浸泡紅豆杉樣品中也可能含有上述物質。一些紫杉烷類化合物具有抗癌活性和細胞毒性[17],作為目標物更有利于食品中違法添加行為的執(zhí)法定性,許多紅豆杉分離得到的黃酮類化合物在其他植物提取物中也同樣存在。試驗選擇紅豆杉紫杉烷類化合物中含量較多的紫杉醇和三尖杉寧堿作為紅豆杉的特征成分的考察對象。

根據(jù)網售紅豆杉酒制作方法的前期調研結果,模擬紅豆杉酒制作方法自制紅豆杉果酒,將自制紅豆杉果酒直接注入質譜儀,分析得到質譜碎片信息,紅豆杉果酒中特征成分的分析結果見表2。

表2 紅豆杉果酒中特征成分的分析結果Tab.2 Analytical results of characteristic components in Taxus fruit wine

由表2可知:紅豆杉果酒中含有紫杉醇和三尖杉寧堿。試驗選擇紫杉醇和三尖杉寧堿作為白酒中紅豆杉的特征成分。

2.2 色譜行為

按儀器工作條件對紫杉醇和三尖杉寧堿混合標準溶液進行測定,其多反應監(jiān)測色譜圖見圖1。

按試驗方法對自制的紅豆杉果酒樣品進行分析,其多反應監(jiān)測色譜圖見圖2。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 色譜柱

紫杉醇和三尖杉寧堿極性較弱,在含有弱極性或非極性固定相的反相色譜柱中均有較好的保留。試驗考察了紫杉醇和三尖杉寧堿在ZORBAX Elicpse Plus C8Rapid Resolution HD 色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8μm)和ACQUITY UPLC R BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm)上的保留情況。結果表明:目標物在ACQUITY UPLC R BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm)上出峰峰形較好,無雜質干擾,響應值較高。試驗選用ACQUITY UPLC R BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm)。

圖1 紫杉醇和三尖杉寧堿混合標準溶液的多反應監(jiān)測色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of mixted standard solution of taxol and cephalomannine

圖2 紅豆杉果酒樣品的多反應監(jiān)測色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of the sample of Taxus fruit wine

2.3.2 流動相

試驗分別考察了以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液等體系為流動相時紫杉醇和三尖杉寧堿的響應情況。結果表明:上述體系作為流動相時,紫杉醇和三尖杉寧堿的峰形都較好,但甲醇-水體系作為流動相時,紫杉醇和三尖杉寧堿的響應值最高。試驗選擇流動相為甲醇-水體系。

2.4 質譜條件的選擇

將50.0μg·L－1紫杉醇和三尖杉寧堿混合標準溶液以針泵進樣方式注入高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀2,在正離子模式下進行全掃描,紫杉醇及三尖杉寧堿形成母離子峰,m/z分別為876.1,854.1。然后施加一定的碰撞電壓進行子離子掃描,選取信號最強的2個子離子分別作為定性和定量離子,優(yōu)化碎裂電壓和碰撞電壓,試驗選擇的碎裂電壓和碰撞電壓見表1。

分析紫杉醇和三尖杉寧堿這2種特征成分的化學結構和母離子、子離子質荷比,可知其裂解規(guī)律如下:紫杉醇和三尖杉寧堿均由一個相同的C6－C8－C6環(huán)結構和一個不同的側鏈基團組成。紫杉醇及三尖杉寧堿均可形成穩(wěn)定的[M＋Na]＋峰,m/z分別為876.1(紫杉醇加鈉峰),854.1(三尖杉寧堿加鈉峰)。碰撞后,以T 代表C6－C8－C6環(huán)結構,SCH代表各自的側鏈基團。紫杉醇m/z為308.0的子離子為[M－T＋Na]＋,m/z為531.0 的子離子為[M－SCH－CH3COOH＋Na]＋;三尖杉寧堿m/z為286.0的子離子為[M－T＋Na]＋,m/z為531.0的子離子為[M－SCH－CH3COOH＋Na]＋。試驗選擇的質譜條件見1.2節(jié)。

2.5 前處理條件的選擇

2.5.1 凈化方法

使用空白白酒樣品配制200.0μg·L－1的紫杉醇和三尖杉寧堿混合標準溶液,考察了C18柱凈化、石墨化炭黑柱凈化、Qu ECh ERS法(N-丙基乙二胺和炭黑吸附劑)凈化以及50倍直接稀釋法進樣等4種凈化方法對紫杉醇和三尖杉寧堿回收率的影響,平行測定6次,結果見表3。

表3 凈化方法對紫杉醇和三尖杉寧堿回收率的影響Tab.3 Effect of purification method on recovery of taxol and cephalomannine%

試驗結果表明:C18柱凈化時流量較慢,耗時較長;QuEChERS法凈化時,紫杉醇和三尖杉寧堿的回收率偏低,重復性較差;直接稀釋法進樣和石墨化炭黑柱凈化時,紫杉醇和三尖杉寧堿的回收率均較好。為了盡量簡化試驗步驟,試驗選用直接稀釋法進樣。

2.5.2 樣品稀釋溶劑

試驗分別考察了樣品稀釋溶劑依次為水、30%甲醇溶液、40%甲醇溶液、50%甲醇溶液、60%甲醇溶液、70%甲醇溶液、80%甲醇溶液和甲醇時對紫杉醇和三尖杉寧堿測定的影響。結果表明:樣品稀釋溶劑為70%甲醇溶液時,紫杉醇和三尖杉寧堿的響應值最高。試驗選擇樣品稀釋溶劑為70%甲醇溶液。

2.5.3 過濾方法

試驗中發(fā)現(xiàn):采用0.22μm 有機濾膜(材質為尼龍66)過濾時,紫杉醇和三尖杉寧堿會被濾膜吸附,紫杉醇損失較大,三尖杉寧堿也有少量損失。因此,樣品溶液上機前不過濾膜,采用離心方式沉淀雜質,減少干擾的同時可以避免過濾造成的紫杉醇和三尖杉寧堿的損失。

2.6 基質效應

測定對象的基質通常會對目標成分的分析過程產生干擾,影響分析結果準確性[18-19]。在實際應用過程中,色譜-質譜法的準確度、精密度很容易受到基質干擾[20],紅豆杉和白酒的成分復雜,因此需要評價所建立的測定方法中基質效應帶來的影響[21]。

采用空白白酒配制基質匹配的紫杉醇和三尖杉寧堿混合標準溶液(0,50.0,100.0,200.0,500.0μg·L－1),同時用樣品稀釋溶劑配制5個相同質量濃度的紫杉醇和三尖杉寧堿混合標準溶液,以基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線的斜率之比與100%的差來考察化合物的基質效應[22-23]。結果表明:紅豆杉酒中紫杉醇和三尖杉寧堿的基質抑制率分別為－9.5%和－6.8%,基質效應表現(xiàn)為弱抑制效應[24]。因此,本方法可以不考慮基質效應對定量的影響。

2.7 標準曲線、檢出限和測定下限

移取適量的1 000 mg·L－1紫杉醇和三尖杉寧堿標準儲備溶液用70%甲醇溶液逐級稀釋混合成低含量和高含量兩種含量梯度的混合標準溶液。低含量的紫杉醇和三尖杉寧堿混合標準溶液系列均含0,0.050,0.100,0.200,0.500,1.00μg·L－1的紫杉醇和三尖杉寧堿。高含量的紫杉醇和三尖杉寧堿混合標準溶液系列含0,20.0,50.0,100.0,200.0,500.0μg·L－1的紫杉醇,0,5.00,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0μg·L－1的三尖杉寧堿。

按儀器工作條件對低含量和高含量的紫杉醇和三尖杉寧堿混合標準溶液系列進行測定,并以紫杉醇和三尖杉寧堿的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。紫杉醇與三尖杉寧堿的線性范圍、線性回歸方程和相關系數(shù)見表4。

表4 線性范圍、線性回歸方程和相關系數(shù)Tab.4 Linearity ranges,linear regression equations and correlation coefficients

以3 倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N),以10倍信噪比計算方法的測定下限(10S/N),得到紫杉醇與三尖杉寧堿的檢出限均為2.5μg·kg－1,測定下限均為8.3μg·kg－1,遠小于市場上紅豆杉酒實際樣品測定值,靈敏度完全可滿足實際測定的需要。紫杉醇和三尖杉寧堿的實際樣品測定值與方法檢出限相差數(shù)百至數(shù)千倍,故低含量和高含量的兩條標準曲線,可分別適用于空白樣品和陽性樣品的分析,可避免標準曲線含量范圍跨越過多數(shù)量級,造成線性擬合失真。

2.8 精密度和回收試驗

按試驗方法對空白白酒樣品進行加標回收試驗,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表5。

表5 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表5可知:回收率為96.4%～116%,RSD 為1.1%～2.6%。本方法的準確度和精密度滿足GB/T 27404－2008《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》的要求。

2.9 樣品分析

按試驗方法對10批網絡平臺購買的紅豆杉酒(紅豆杉果酒、紅豆杉樹皮酒)進行分析,結果見表6。

表6 樣品分析結果Tab.6 Analytical results of the samples mg·kg－1

由表6可知:10份樣品均檢出紅豆杉特征成分紫杉醇和三尖杉寧堿,紅豆杉樹皮酒中紫杉醇和三尖杉寧堿的含量比紅豆杉果酒中紫杉醇和三尖杉寧堿的含量高。本方法適用于紅豆杉果酒和紅豆杉樹皮酒的識別。

按試驗方法對市場上常見的植物類保健酒樣品和配制酒樣品進行分析,以驗證方法的特異性。試驗分析了3批次枸杞酒、1批次桂圓枸杞酒、2批次參酒、1批次八珍酒、2批次露酒等9批保健酒,1批次純谷酒、1批次苦蕎酒共2批次配制酒,這些酒的原料涉及枸杞、桂圓、人參、黃芪、五加皮、肉桂、天麻、杜仲、黃精、木瓜、黑桑椹、葛根、山楂、沙棘等中藥材或植物。結果表明:11批樣品均未檢出紫杉醇和三尖杉寧堿,說明其他植物類酒并未含有紫杉醇和三尖杉寧堿,本方法特征成分的選取和測定具有特異性。

本工作建立了測定白酒中紅豆杉特征成分紫杉醇和三尖杉寧堿含量的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法,方法步驟簡便、快速,方法學指標符合食品理化檢測質量控制規(guī)范。通過本方法分析網絡平臺購買的紅豆杉酒樣品,全部樣品均檢出紫杉醇和三尖杉寧堿,而對其他若干種中藥材保健酒樣品的分析均未檢出紫杉醇和三尖杉寧堿。這表明網絡平臺售賣的所謂紅豆杉酒存在較大食品安全風險。本方法可應用于酒中紅豆杉特征成分含量的測定,為市場監(jiān)管部門對酒中非法添加紅豆杉違法行為的執(zhí)法稽查提供了技術支持,為進一步制定食品中非法添加紅豆杉補充檢驗方法和國家檢測標準提供了技術基礎。另外,可通過本方法對市場上出現(xiàn)的可疑紅豆杉酒開展監(jiān)測和分析,為市場監(jiān)管部門制定食品安全風險監(jiān)測計劃提供依據(jù),有利于遏制紅豆杉被誤用、濫用或違規(guī)使用的勢頭。