石墨化多壁碳納米管復(fù)合凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物源性食品中乙氧呋草黃殘留量

楊 飛 ,方智三 ,劉 俊 ,粟有志

(1.新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院,烏魯木齊 830011; 2.烏魯木齊海關(guān)技術(shù)中心,烏魯木齊 830063;3.伊寧海關(guān)技術(shù)中心,伊寧 835000)

乙氧呋草黃又名甜菜呋、甜菜凈、乙呋草黃,化學(xué)名稱2-乙氧基-2,3-二氫-3,3-二甲基-5-苯并呋喃甲基磺酸酯,其通過減少植物的光合作用和呼吸作用來抑制細胞分裂,從而控制闊葉雜草和禾本科雜草的生長,是一種低毒、廣譜選擇性除草劑[1-4]。GB 2763－2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了乙氧呋草黃在甜菜根中的最大殘留限量為0.1 mg·kg－1;美國環(huán)保署修訂了乙氧呋草黃在甜菜根和甜菜糖漿中的最大殘留限量分別為1.5,2.0 mg·kg－1;日本肯定列表規(guī)定乙氧呋草黃在甘藍、胡蘿卜、番茄等植物源性食品中的最大殘留限量為0.1～1.0 mg·kg－1。然而當(dāng)前國內(nèi)外尚無食品中乙氧呋草黃殘留量的測定方法標(biāo)準(zhǔn)。文獻報道的乙氧呋草黃測定方法主要有液相色譜法[5-7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-15]。液相色譜法為半定性分析方法,不能對目標(biāo)物進行確證;氣相色譜-質(zhì)譜法雖然可對目標(biāo)物進行確證,但存在抗基質(zhì)干擾能力弱、檢出限較高等缺點;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以多殘留分析為主,缺少對乙氧呋草黃進行較為全面系統(tǒng)的研究,同時亦未對糖蜜、胡蘿卜等樣品進行方法學(xué)考察。本工作改進了傳統(tǒng)的QuECh ERS 前處理,以石墨化多壁碳納米管(MWNTs)、強陰離子交換機理的硅膠和N-丙基乙二胺等3種材料為凈化劑,結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了植物源性食品中乙氧呋草黃殘留量測定的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜-6460A 型串聯(lián)質(zhì)譜儀,配電噴霧離子源和Optimizer軟件;GM 200型刀式混合研磨儀;EYELA MMV-1000W 型振蕩器;Sigma 3-18K 型臺式冷凍離心機;N-EVAP-112型水浴氮吹儀;IKA MS3型渦旋振蕩器;Milli-Q Advangtage A10型超純水系統(tǒng)。

乙氧呋草黃標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1 000 mg·L－1,稱取乙氧呋草黃標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,用少許甲醇溶解后,用甲醇定容于10 mL容量瓶中,于4 ℃避光保存。

石墨化多壁碳納米管(XFM40,直徑10～20 nm,長度5～30μm)、石墨化羧基多壁碳納米管(XFM42,直徑10～20 nm,長度5～30μm)、多壁碳納米管(XFM13,直徑10～20 nm,長度10～30μm)、石墨化多壁碳納米管(XFM25,直徑30～50 nm,長度小于10μm)、石墨化多壁碳納米管(XFM04,直徑5～15 nm,長度0.5～2μm);石墨化碳黑(GCB)、C18粉、氨基鍵合硅膠(NH2)、N-丙基乙二胺(PSA,粒徑40～60 μm)、酸性氧化鋁(ALA)、硅酸鎂吸附劑(Florisil,粒徑150～200μm);強陰離子交換機理的硅膠(SAX,粒徑50μm)、強陽離子交換機理的硅膠(SCX,粒徑50μm)、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯極性增強聚合物(PEP,粒徑80～10μm)、強陽離子交換混合機理的水可浸潤型聚合物(PCX,粒徑40～60μm)、弱陽離子交換混合機理的水可浸潤型聚合物(PWCX,粒徑40～60μm)、強陰離子交換混合機理的水可浸潤型聚合物(PAX,粒徑40～60μm)、官能化聚苯乙烯/二乙烯苯中等極性聚合物(HXN,粒徑40～60μm)。

乙氧呋草黃標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99%;其余試劑均為色譜純;試驗用水為超純水系統(tǒng)制備的一級水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 JADE-PAK CB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,3 μm),柱溫30 ℃;進樣量10.0μL;流量0.25 mL·min－1。流動相:A 為0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸溶液,B 為乙腈。梯度洗脫程序:0～0.5 min 時,B 為5%;0.5～1.0 min時,B由5%升至75%;1.0～6.5 min時,B 由75%升至95%,保持1.0 min;7.5～7.6 min時,B由95%降至5%。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),正離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;毛細管電壓4 k V;干燥氣溫度350 ℃,干燥氣流量11.0 L·min－1;鞘氣溫度250 ℃,鞘氣流量10.0 L·min－1;碎裂電壓140 V;駐留時間50 ms。定性離子對質(zhì)荷比(m/z)為286.9/121.1,286.9/259.1,286.9/161.1,碰撞能量分別為4,16,12 e V,其中m/z286.9/121.1為定量離子對。

1.3 試驗方法

樣品為流通市場隨機抽檢樣品和試驗室日常送檢樣品。

西紅柿、黃瓜、梨等含水量較高的樣品:稱取5.00 g于50 mL 具塞離心管中,加入10 mL 正己烷。大豆、玉米、大米等含水量較少的樣品:稱取5.00 g于50 mL 具塞離心管中,加入15 mL 水,浸泡30 min后,加入20 mL 正己烷。將上述離心管水平振蕩10 min,以8 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心3 min,取上層(正己烷層)的1/2 體積(5 mL 或者10 mL)于20 mL玻璃試管中,于40 ℃水浴中氮吹至干,加入5 mL 的50%(體積分數(shù),下同)乙腈溶液,再加入1 g 氯化鈉,渦旋10 s溶解殘渣,靜置5 min。取上清液1.5 mL 于預(yù)先裝有吸附劑(XFM40、SAX、PSA 各50 mg)的2 mL帶蓋離心管中,蓋好離心管蓋子,渦旋30 s,以10 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min,移取上清液,過0.22μm 尼龍濾膜至進樣小瓶,按儀器工作條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

分別以0.1% 甲酸溶液、含0.1% 甲酸的10 mmol·L－1乙酸銨溶液、10 mmol·L－1乙酸銨溶液、水為流動相的A 相(無機相),乙腈、甲醇為流動相的B 相(有機相),通過不同A 相與B 相的組合,優(yōu)化乙氧呋草黃的流動相。結(jié)果表明:0.1%甲酸溶液和乙腈組合時,乙氧呋草黃的離子對信號最好,離子化效益最高。試驗選擇流動相為0.1%甲酸溶液和乙腈。

試驗通過進一步設(shè)定梯度洗脫,有效降低了基質(zhì)對乙氧呋草黃的干擾,獲得較好的分離度和響應(yīng)信號。試驗選擇的色譜條件見1.2節(jié)。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

分別用電噴霧離子源正離子掃描(ESI＋)和電噴霧離子源負離子掃描(ESI－)對同一質(zhì)量濃度的乙氧呋草黃標(biāo)準(zhǔn)溶液進行母離子掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn):[M＋H]＋(m/z286.9)的響應(yīng)信號明顯優(yōu)于[M＋H]－(m/z285.0)的響應(yīng)信號。這說明乙氧呋草黃適用ESI＋,試驗選用ESI＋。

采用Optimizer軟件分別對子離子、碎裂電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化,最終選擇了測定信號較強、本底干擾較小的m/z286.9/121.1、m/z286.9/259.1和m/z286.9/161.1這3對離子對作為定性離子對,其中測定信號最強的m/z286.9/121.1為定量離子對。試驗選擇的質(zhì)譜條件見1.2節(jié)。

乙氧呋草黃的可能裂解途徑見圖1。

圖1 乙氧呋草黃的可能裂解途徑Fig.1 Possible fragmentation pathway of ethofumesate

2.3 前處理條件的選擇

試驗選用色素含量較高、基質(zhì)成分復(fù)雜的黃瓜作為方法優(yōu)化樣品,添加乙氧呋草黃標(biāo)準(zhǔn)溶液至黃瓜樣品中(乙氧呋草黃的質(zhì)量分數(shù)為50.0μg·kg－1)。試驗考察了提取劑依次為正己烷、乙腈、1%(體積分數(shù),下同)甲酸乙腈溶液、丙酮、乙酸乙酯時對乙氧呋草黃提取效率的影響。結(jié)果表明:提取劑為丙酮時,乙氧呋草黃的回收率僅為72.5%,其余4種提取劑的回收率為90.0%～100%。

根據(jù)相對響應(yīng)值公式[公式(1)]計算乙氧呋草黃的基質(zhì)效應(yīng):

式中:χME為基質(zhì)效應(yīng);Am 為空白基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值;Ac為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值。

基質(zhì)效應(yīng)大于100%時,為基質(zhì)增強效應(yīng);基質(zhì)效應(yīng)小于100%時,為基質(zhì)抑制效應(yīng)。

試驗進一步考察了提取劑依次為正己烷、乙腈、1%甲酸乙腈溶液、乙酸乙酯時,乙氧呋草黃在黃瓜樣品中的基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果分別為49.8%,56.6%,54.3%,48.5%。試驗還發(fā)現(xiàn):提取劑為乙腈和1%甲酸乙腈溶液時,提取液顏色較深,含有部分的色素;提取劑為正己烷和乙酸乙酯時,提取液的顏色較為清澈。綜合考慮樣品基質(zhì)效應(yīng)和色素凈化效果,試驗選擇提取劑為正己烷和乙腈。

試驗考察了正己烷提取、乙腈提取和以正己烷進行第一次提取后,再用50%乙腈溶液進行二次提取(簡稱二次提取)等3種提取方法對乙氧呋草黃在黃瓜、梨、甘藍、葡萄、土豆、大米、大豆、玉米、糖蜜、甜菜、胡蘿卜、番茄等12種基質(zhì)樣品中基質(zhì)效應(yīng)的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 提取方法對乙氧呋草黃基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.2 Effect of extraction method on matrix effect of ethofumesate

由圖2可知:經(jīng)過二次提取之后,乙氧呋草黃的基質(zhì)效應(yīng)得到了明顯的改善。試驗中樣品以正己烷進行第一次提取后,再用50%乙腈溶液進行二次提取。

按試驗方法采用XFM40、XFM42、XFM13、XFM25、XFM04、GCB、C18、NH2、PSA、ALA、Florisil、SAX、SCX、PEP、PCX、PWCX、PAX、HXN 等18種吸附劑(用量均為50 mg),分別對黃瓜樣品進行凈化,吸附劑對乙氧呋草黃回收率的影響見圖3。

由圖3 可知:吸附劑為SCX、PCX、PWCX、HXN、XFM42、XFM13時,乙氧呋草黃的回收率小于80.0%;吸附劑為其余12 種吸附劑(XFM40、XFM25、XFM04、GCB、C18、NH2、PSA、ALA、Florisil、SAX、PEP、PAX)時,乙氧呋草黃的回收率為80.0%～115%,均可滿足方法學(xué)的要求。

圖3 吸附劑對乙氧呋草黃回收率的影響Fig.3 Effect of adsorbent on recovery of ethofumesate

試驗進一步考察了其余12種吸附劑(XFM40、XFM25、XFM04、GCB、C18、NH2、PSA、ALA、Florisil、SAX、PEP、PAX)對乙氧呋草黃基質(zhì)效應(yīng)的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 吸附劑對乙氧呋草黃基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.4 Effect of adsorbent on matrix effect of ethofumesate

由圖4 可知:吸附劑為GCB、XFM40、SAX、PSA、NH2時,乙氧呋草黃的基質(zhì)效應(yīng)優(yōu)于其他吸附劑存在時乙氧呋草黃的基質(zhì)效應(yīng)。GCB 和XFM40均具有較強的吸附色素能力,兩者用量均為50 mg時,XFM40吸附后,提取液更為清澈,因此試驗選擇XFM40作為色素去除劑。PSA 和NH2均具有銨根基團,對酸性化合物具有吸附作用,二者的吸附機理類似,但PSA 凈化時,乙氧呋草黃的基質(zhì)效應(yīng)略優(yōu)于NH2凈化時乙氧呋草黃的基質(zhì)效應(yīng),因此試驗選擇PSA 進行下一步試驗。試驗最終選擇XFM40、SAX、PSA 這3種吸附劑共同凈化樣品。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

按試驗方法以黃瓜、梨、甘藍、葡萄、土豆、大米、大豆、玉米、糖蜜、甜菜、胡蘿卜、番茄等12種樣品為基質(zhì),乙氧呋草黃的基質(zhì)效應(yīng)見表1。

表1 乙氧呋草黃的基質(zhì)效應(yīng)Tab.1 Matrix effect of ethofumesate

由表1可知:不同的樣品基質(zhì)均對乙氧呋草黃有一定的基質(zhì)效應(yīng)。試驗采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線可有效彌補基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的干擾。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

稱取黃瓜、梨、甘藍、葡萄、土豆、大米、大豆、玉米、糖蜜、甜菜、胡蘿卜、番茄等空白樣品各5.00 g,按試驗方法進行前處理,獲得空白基質(zhì)濾液,逐步用空白基質(zhì)濾液稀釋1 000 mg·L－1乙氧呋草黃標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,獲得20,40,100,200,500,100μg·L－1的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

按儀器工作條件對上述標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進行測定,以乙氧呋草黃的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),與其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:乙氧呋草黃在不同基質(zhì)中的線性范圍均為20～100μg·L－1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結(jié)果見表2。

2.6 方法的準(zhǔn)確度和精密度

按試驗方法對黃瓜、梨、甘藍、葡萄、土豆、大米、大豆、玉米、糖蜜、甜菜、胡蘿卜、番茄等空白樣品進行加標(biāo)回收試驗,每個添加水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

由表3可知:回收率為74.1%～121%,RSD 為2.8%～16%。

空白黃瓜樣品的色譜圖見圖5,空白黃瓜加標(biāo)樣品的色譜圖見圖6。

表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和測定下限Tab.2 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

表3 準(zhǔn)確度和精密度試驗結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for accuracy and precision(n＝6)

圖5 空白黃瓜樣品的色譜圖Fig.5 Chromatograms of the blank sample of cucumber

2.7 樣品分析

按試驗方法對市場上流通銷售的12種植物源性食品(黃瓜、梨、甘藍、葡萄、土豆、大米、大豆、玉米、糖蜜、甜菜、胡蘿卜、番茄)共計100余份樣品進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在1 份甜菜樣品中檢出25.2μg·kg－1乙氧呋草黃,其余樣品中均未檢出乙氧呋草黃。

圖6 空白黃瓜加標(biāo)樣品的色譜圖Fig.6 Chromatograms of the blank sample of cucumber added with standard

本工作采用石墨化多壁碳納米管復(fù)合凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物源性食品中乙氧呋草黃的殘留量,方法簡便快捷、靈敏度高、實用性強,試驗結(jié)果符合殘留測定的相關(guān)要求,可為植物源性食品中乙氧呋草黃殘留量的檢驗監(jiān)管提供技術(shù)支撐。