姜荷花清邁粉基因組大小測定

毛俐慧，金亮，丁華僑，董青，胡偉，田丹青

(浙江省園林植物與花卉研究所，浙江 杭州 311251)

基因組大小是指生物單倍體基因組的DNA含量，又稱DNAC值?；蚪M大小是生物體的基本生物學屬性，同屬物種間各異。根據英國邱園網站的數據庫(https://cvalues.science.kew.org)，現已有12 273種植物有DNAC值數據，其中包括被子植物10 770種，裸子植物421種，蕨類植物303種，苔蘚植物334種，藻類445種。姜荷花(Curcumaalismatifolia)隸屬于姜黃屬，是一種熱帶觀賞花卉，原產于泰國和印度，因其形態如蓮，常作佛教用花。于2000年左右引進中國，在西雙版納、海南等熱帶地區，以及廣東、廣西、福建等南亞熱帶地區適應良好。近些年本課題組在姜荷花種球抗寒、繁殖等方面做了一系列的工作[1-2]，使其在江浙滬甚至長江流域地區的栽培、越冬等技術難題得到解決。目前，姜荷花已經在我國園林、盆栽等方面有廣泛應用，其花葶高度適中(40～60 cm)，也是重要的切花。姜黃屬植物多數分布在印度和泰國，兩地分別都有40種以上，鑒于還沒有系統的分類修訂，該屬總種數還不十分清楚，估計有100種左右主要分布于南亞、東南亞，少數在中國、澳大利亞、南太平洋地區[3]。姜黃屬植物許多物種都具有較高經濟、藥用、觀賞價值，最被熟知的姜黃(C.longaL.)是重要的香料，也可做藥用，具有抗癌、抗炎、降血脂等功效。姜黃屬已有33種植物具有基因組大小數據，該屬植物基因組大小介于0.83 pg(Curcumavamana)與2.38 pg(Curcumaoligantha)[4]，然而姜荷花作為新興的重要觀賞花卉，基因組大小還未知。

流式細胞術是進行快速定量分析分選單個細胞液體流的技術[5]。利用熒光染料對細胞核內DNA進行染色，檢測核DNA含量，分析植物倍性，目前已經得到廣泛應用[6-8]。本研究擬測定姜荷花的基因組大小，為基因組學研究、倍性育種研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

姜荷花清邁粉的幼苗種植于浙江省園林植物與花卉研究所大棚，摘取新鮮嫩葉作為實驗材料。參考標準為蘿卜Saxa(RaphanussativusL.Saxa)，來自捷克科學院實驗植物研究所，其基因組大小為2C=1.11 gp，1C=543 Mbp。該材料種植于浙江省園林植物與花卉研究所光照培養間，摘取新鮮嫩葉作為標準植株的實驗材料。

1.2 方法

1.2.1 姜荷花細胞核懸液的制備與DNA染色

采用CyStain PI Absolute P(Sysmex-Partec，05-5022)試劑盒提取細胞核并染色。取少量姜荷花清邁粉新鮮嫩葉，蒸餾水清洗，濾紙擦拭，將葉片放入加有0.5 mL裂解液的培養皿中，用雙面刀片快速切碎葉片，靜置5 min，用30 μm過濾器過濾獲得細胞核懸液。在制備好的細胞核懸液中加入染色液(含PI，RNase)，避光染色5 min。采用同樣方法制備蘿卜細胞核懸液。

1.2.2 上機檢測與數據分析

采用CyFlow Ploidy Analyser(德國Sysmex-Partec)流式細胞儀進行基因組大小分析。該機配備532 nm綠色激光器。每個樣品檢測細胞核數至少為5 000個。檢測所得數據用ModFit LT(美國Verity Software House公司)軟件進行分析。先檢測蘿卜細胞核懸液樣本，再檢測姜荷花、蘿卜數量比1∶1混合細胞核懸液。姜荷花的基因組大小計算公式為：姜荷花C值=(姜荷花峰的熒光強度均值/蘿卜Saxa峰的熒光強度均值)×蘿卜Saxa的C值。

2 結果與分析

流式細胞儀測定結果見圖1，通過比較G0/G1期的峰值，可得出姜荷花基因組大小。姜荷花清邁粉的基因組大小是蘿卜Saxa的1.84倍，蘿卜Saxa基因組大小為543 Mbp，可估算出姜荷花清邁粉的基因組大小約為998.5 Mbp(1C=88.89/48.43×543=998.5 Mbp)，即C值為1.02 pg。圖中紅色和黃色主峰的峰值分別是蘿卜和姜荷花的G0/G1期的峰值。

圖1 姜荷花清邁粉基因組流式細胞儀分析 檢測結果

3 討論

基因組大小是生物體重要的特性參數，研究發現，基因組大小與植物對氮水添加的響應、對氣候的適應，以及植物的入侵性大小都具有相關性。小基因組植物地上凈初級生產力(ANPP)對氮水添加響應更敏感，水和氮水共同添加使DNAC值小的植物ANPP顯著增加[9]。對單子葉植物核DNA含量與氣候的適應性分析表明，在中等溫度和雨量環境下，核DNA含量最高，溫度和水分趨向極端的環境下其核DNA含量較低[10]。入侵植物常具有更小的DNAC值，統計的47種入侵雜草的DNAC值平均為1.76 pg，極顯著小于非雜草性草本植物(6.75 pg)[11]。

不同物種植物的基因組大小不同，對25種鳶尾屬植物的流式細胞儀測定表明，該屬基因組大小為2.62～6.77 pg[12]。依據邱園網站提供的資料，姜黃屬植物的DNAC值為0.83～2.38 pg。有研究綜述前人的研究結果表明，植物種內甚至存在基因組大小的變異，這些變異通常和生態功能的分化相關，緯度、海拔、營養條件、光照等可能會對基因組大小產生一定的影響[13]。本研究僅測定了單一地理來源的姜荷花清邁粉的基因組大小，對姜荷花的基因組大小尚沒有全面的認識，后續研究可以對姜荷花不同品種，以及同個品種不同群體的樣本進行基因組大小測定，從而對姜荷花基因組大小有更全面的了解。

本研究用流式細胞儀，豐富了姜荷花的生物學特征資料，為姜荷花基因組測序提供了必要的參考數據，也為倍性育種結果檢測提供了參考依據。同時為姜科其他物種的基因組大小測定提供技術和方法上的參考。