流感病毒和冠狀病毒的細胞表面結合與內化*

鮑美美 楊愷 元冰

(蘇州大學軟凝聚態物理及交叉研究中心, 蘇州 215006)

1 引 言

病毒是一種非細胞型生物, 體積微小. 最大的牛痘病毒直徑約為300 nm, 最小的核糖核酸病毒直徑僅有20 nm左右. 病毒大多為球形或近似球形, 少數為桿狀、絲狀等. 病毒由核酸 (DNA 或RNA) 及外面包裹的蛋白質核衣殼組成, 有的病毒表面還具有一層脂質雙層膜. 盡管一些病毒能直接與細胞膜融合將遺傳物質釋放到細胞質中 (比如人類免疫缺陷病毒HIV), 但大部分病毒仍以通過穿透細胞膜的方式侵入胞內, 然后復制增殖, 從而將遺傳物質傳遞至宿主細胞. 現在已知的病毒侵入細胞的途徑包括網格蛋白介導的內吞、小窩/脂筏介導的內吞、巨胞飲及非網格蛋白非小窩結構依賴的內吞等[1,2]. 在這些途徑當中, 網格蛋白介導的內吞是最常見的病毒侵入途徑.

病毒是人類健康的巨大威脅. 僅在21世紀,世界范圍內已發生了5次大規模的呼吸道病毒流行病, 引起這些大流行的病毒分別屬于流感病毒和冠狀病毒, 包括嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)[3], H1N1 甲型流感病毒[4], 中東呼吸綜合癥冠狀病毒 (MERS-CoV)[5], 亞洲H7N9甲型流感病毒[6], 以及現在仍在蔓延的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)[7]. 流感病毒和冠狀病毒同屬于包膜病毒. 與流感病毒相比, 冠狀病毒具有更強的傳染能力和更高的致死率. 病毒大都通過表面突出的糖蛋白與宿主細胞膜上特定的受體進行結合[8], 繼而在細胞因子的參與下, 通過不同的內化途徑侵入細胞.細胞內吞體的低pH環境會誘導病毒膜與內吞體膜發生融合并釋放遺傳物質, 使其進入核內進行復制和組裝, 最后轉運至細胞膜出芽形成新的病毒體.

按照核蛋白的抗原性, 流感病毒可分為甲(A)、乙 (B)、丙 (C)、丁 (D) 四型. 人流感主要是 A 型和B型流感病毒引起的, C型流感病毒只引起人類不明顯的或輕微的上呼吸道感染, D型流感病毒的宿主主要是牛. 目前相關研究主要聚焦于探究流感病毒侵入細胞的途徑[9], 追蹤其感染細胞的運動軌跡[10], 闡明其膜融合機制[11], 揭示其胞內轉運的各個階段[12], 以及探索遺傳物質入核出核的過程[13]等. 另一方面, 對于冠狀病毒, 國際病毒分類委員會 (The International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) 將其分為 4 個屬, 即 a, b,g及新假定的d冠狀病毒屬. SARS-CoV-2是近期新發現的一種b屬冠狀病毒, 有很強的傳染能力. 目前已經檢測出SARS-CoV-2的全基因組序列及病毒與細胞結合的蛋白等, 但對于它通過何種路徑侵入并感染細胞的機制尚不清楚.

流感病毒和SARS-CoV-2結構相似, 直徑大多分布在幾十至幾百納米范圍內, 都是利用表面突出的糖蛋白與細胞膜上的受體相結合. 這兩種病毒主要是感染人的呼吸系統, 引發發熱、咳嗽等癥狀,嚴重者甚至造成肺部的感染. 值得注意的是, 臨床上常選用抗流感病毒的藥物, 如鳥嘌呤類似物法匹拉韋[14]、神經氨酸酶抑制劑奧司他韋[14]及中藥疏風解毒膠囊[15]和蓮花清瘟膠囊[16]等都對SARSCoV-2的治療顯示出了一定的效果. 這表明SARS-CoV-2與流感病毒在感染細胞的過程中存在一定的相似性. 這也提示我們可以參考借鑒流感病毒感染細胞的路徑來探究SARS-CoV-2與細胞的相互作用. 本文從該角度出發, 重點闡述流感病毒與細胞受體的結合及在多種細胞因子的參與下侵入細胞的路徑, 最后介紹了SARS-CoV-2與細胞作用的相關研究進展, 旨在為當前SARS-CoV-2的相關研究提供幫助.

2 流感病毒的細胞結合與內化

2.1 流感病毒的結構

流感病毒屬于正粘病毒科, 是一種包膜病毒,膜上鑲嵌著3類膜蛋白: 血凝素 (hemagglutinin,HA)、神經氨酸酶 (neuraminidase, NA) 和膜蛋白M2 (membrane protein 2, M2)[17]. HA 以同源三聚體的形式存在. HA水解后形成輕鏈和重鏈兩部分, 其中重鏈負責病毒與細胞的結合, 而輕鏈則協助病毒膜與內吞體膜的半融合. NA是蘑菇狀的四聚體糖蛋白, 具有水解唾液酸的活性, 能幫助病毒從宿主細胞中釋放. 膜蛋白M2具有離子通道和調節膜內 pH 的作用. 此外, 基質蛋白 M1 (matrix protein 1, M1) 構成病毒的外殼骨架, 與病毒最外層的包膜緊密結合, 起到保護病毒核心和維持病毒空間結構的作用. 病毒的遺傳物質是單股負鏈RNA與核蛋白折疊在一起形成的病毒核糖核蛋白(virus ribonucleoprotein, vRNP) 復合物[17](圖 1(a)).

流 感 病 毒 的 形 狀 多 樣. 1946 年, Mosley 和Wyckoff[18]首次利用電子顯微鏡從感染流感病毒的雞胚尿囊液中觀察到絲狀流感病毒. 不同于已發現的尺寸約 80 nm的球狀 A型流感病毒株RP8[19]及100 nm左右的B型流感病毒株Lee[20],絲狀病毒的長度不一, 從幾百納米至幾十微米, 但寬度小于球狀病毒. 另外還存在一類長度小于250 nm、寬度約為95 nm左右的桿狀流感病毒株.臨床分離的A2流感病毒在雞胚中生長兩代后會出現絲狀病毒, 但十二代后只見球狀病毒 (圖1(b)和圖1(c))[21], 這可能是由于合成絲狀病毒需要宿主提供更多特定的膜蛋白, 在傳代過程中處于劣勢, 導致最后只剩下球狀病毒. 病毒形狀的不同主要由其遺傳性狀決定[22].

圖 1 流感病毒的結構與形狀[17,21] (a) 絲狀、桿狀與球狀流感病毒模型圖, 流感病毒是包被病毒, 最外層是脂質膜,膜上含有HA和NA兩種糖蛋白及M2通道蛋白, 膜下是基質蛋白M1, 絲狀病毒的基因組位于遠端, 球狀病毒的基因組位于中心; (b) 絲狀病毒和(c) 球狀病毒的電子顯微鏡照片Fig. 1. Composition and shape of influenza virus[17,21]: (a) Filamentous, rod-shaped and globular influenza virus models;(b), (c) representative electron microscopy images of filamentous and globular viruses, respectively.

2.2 流感病毒與細胞的結合

病毒感染細胞一般始于其吸附到細胞表面并經特定路徑侵入細胞. 流感病毒主要通過HA的重鏈與呼吸道或腸上皮細胞上的唾液酸相結合[23].這是流感病毒與宿主細胞結合的主要靶向分子(表1). 唾液酸位于細胞膜上糖蛋白和糖脂的末端,通過 a-2, 3 或 a-2, 6 糖苷鍵連接到半乳糖上. HA特異性的親和力主要是由唾液酸的拓撲結構決定的: 人源流感病毒優先結合至a-2, 6糖苷鍵連接的長鏈傘狀的唾液酸, 而禽流感病毒一般結合到a-2,3糖苷鍵連接的短圓錐狀結構的唾液酸[24,25]. 有研究顯示禽流感病毒H3 N2也傾向于結合到人源唾液酸a-2, 6糖苷鍵連接的糖蛋白分支上[26], 從而導致不同物種間的傳染. 實際上, HA與唾液酸的親和力較弱. 但由于哺乳動物細胞表面唾液酸含量豐富, 因此病毒能高效地結合到細胞上[27].

表 1 流感病毒與宿主細胞結合的靶向分子Table 1. Targeting molecules for influenza virus binding to host cells.

除此之外, 流感病毒與細胞的結合還涉及宿主細胞膜上的固醇及脂筏結構. 體外實驗發現流感病毒與細胞的親和力依賴于膜上固醇的類別和濃度;分子模擬結果也顯示流感病毒在含膽固醇的雙層膜上會形成含雙唾液酸神經節苷脂的納米簇, 進而促進病毒與膜的結合[28,29]. 單分子示蹤和活細胞實時熒光實驗結果顯示, A型流感病毒 (influenza A virus, IAV) 與脂筏的標記物神經節苷脂單唾液酸四己糖共定位, 并且從感染IAV的細胞膜提取的脂筏結構中也檢測到病毒蛋白. 此外, 在破壞膜上脂筏結構后, IAV的結合能力顯著下降. 這些現象都證實病毒包被中濃縮的HA能夠有效結合至脂筏區的唾液酸從而實現高親多價結合[30].

然而, 流感病毒與細胞的結合具有復雜性特點. 一些研究表明病毒可能通過HA與不含唾液酸的磷酸化糖蛋白結合侵入人肺部細胞[31]. Ng等[32]的研究顯示, IAV能夠通過HA上富含甘露糖的糖鏈識別細胞表面凝集素完成吸附, 并感染表達了C型凝集素Langerin的倉鼠卵巢癌細胞Lec2.

2.3 流感病毒的細胞內化途徑

大多數流感病毒結合至細胞表面后, 會在不同細胞因子的誘導下以內吞的方式侵入細胞, 完成內化. 細胞的內吞途徑通常分為網格蛋白介導的內吞、小窩結構介導的內吞、吞噬、巨胞飲及吞飲等途徑[33]. 其中網格蛋白和小窩結構途徑屬于受體介導的內吞; 吞噬一般僅限于特定的細胞比如巨噬細胞和中性粒細胞, 主要用于攝取大的顆粒物、消滅感染的細菌等; 巨胞飲途徑是將液體和顆粒內化侵入細胞的非特異性過程; 而吞飲作用是從細胞外部環境吸收生物液體[34]. 科學家們曾利用透射電子顯微鏡技術研究流感病毒侵入細胞的方式. 形態學圖像分析顯示病毒會結合到細胞表面的有被小窩中, 這說明流感病毒可能是以網格蛋白介導的方式侵入細胞的[35,36]; 與此同時, 也觀察到病毒位于表面沒有包被且光滑的凹陷結構內, 這說明病毒還可能以其他途徑侵入細胞. 現有研究表明, 流感病毒侵入細胞的內吞路徑具有多樣化的特點, 網格蛋白介導的內吞、小窩結構參與的內吞、巨胞飲作用、非網格蛋白/非小窩結構的內吞等都有可能是病毒內化的途徑[37?39](圖 2).

2.3.1 網格蛋白介導的病毒內吞

網格蛋白介導的方式 (clathrin mediated endocytosis, CME) 是流感病毒實現細胞內吞的主要途徑. 莊小威課題組[40]利用單分子示蹤及熒光共定位成像技術實時觀察單個流感病毒侵入非洲綠猴正常腎上皮細胞BS-C-1的過程, 發現65%的內化病毒在相當長的一段時間內會與網格蛋白包被的結構相關聯, 而其余35%的病毒與包被網格蛋白的結構沒有任何聯系, 說明大多數病毒通過網格蛋白介導的方式侵入細胞, 而其余病毒則會采用其他方式侵入; 這兩種途徑同時存在且具有相似的膜融合效率. 與此類似, 在馬-達二氏犬腎細胞MDCK體系中, Whittaker課題組[41]發現在流感病毒結合位點處, 網格蛋白的熒光會逐漸增強、達到峰值后趨于穩定. 這表明網格蛋白包被小窩 (clathrin coated pit, CCP) 產生并漸漸成熟; 而當 CCP 內吞后形成網格蛋白包被小泡 (clathrin coated vesicle, CCV)、進行胞內轉運后, 熒光會逐漸減弱直至消失. 另一方面, 單分子追蹤實驗數據表明約85%的病毒內化需要網格蛋白的參與[42]. 此外, 研究人員對流感病毒、網格蛋白、動力蛋白分別進行熒光標記和實時追蹤, 發現動力蛋白也會參與網格蛋白與流感病毒的相互作用過程[42], 甚至在抑制CME途徑、非網格蛋白依賴的內吞 (clathrin independent endocytosis, CIE) 途徑的條件下, 仍然觀察到了動力蛋白的聚集現象. 然而在這種情況下, 侵入細胞的病毒數量會減少至原來的2/3, 這也間接驗證了流感病毒內化更傾向于CME途徑.

圖 2 流感病毒在細胞表面結合及內化示意圖. 流感病毒與細胞表面的糖蛋白或糖脂末端的唾液酸、或者磷酸化的糖蛋白、抑或是C型凝集素Langerin發生結合, 之后在G蛋白偶聯受體FFAR2、表達于膜上的核仁蛋白、適配體蛋白Epsin1和EPS15、C型凝集素Langerin等細胞因子的參與下, 通過網格蛋白介導的方式發生內吞. 胞內Ca2+的增加可以促進流感病毒通過網格蛋白或非網格蛋白的方式侵入細胞, 另外膜上脂筏結構也參與病毒的吸附和內化過程Fig. 2. Schematic diagram of influenza virus binding and internalization at cellular surface. The influenza virus binds on the cell surface with sialic acid at the end of a glycoprotein or lipid, phosphorylated glycoprotein, or C-type lectin Langerin, and then enters into the cell through clathrin-mediated endocytosis with the participation of cytokines such as G protein coupled receptor FFAR2,nucleolus protein expressed in membrane, adapter proteins Epsin1 and EPS15, or C-type lectin Langerin. An increased amount of intracellular Ca2+ promotes the entry of influenza virus in the clathrin or non-clathrin way. Lipid rafts also play roles in the process of virus adsorption and internalization.

2.3.2 病毒內化過程對小窩結構的依賴性

小窩是細胞膜表面燒瓶狀的內陷結構, 直徑約50—100 nm, 內含豐富的膽固醇、鞘糖脂和小窩蛋白[43]. 這種結構主要分布在一些內皮細胞、纖維細胞、脂肪細胞及肌肉細胞內[44], 參與細胞內吞、胞吞轉運、膜內穩態、炎癥反應及信號傳導等. 菲律賓菌素是常用的固醇特異性結合試劑, 與細胞作用后會抽出脂筏中的膽固醇從而破壞小窩結構[45].為了探究小窩介導的內吞作用在流感病毒內化中的潛在貢獻, Nunes-Correia等[46]檢測了菲律賓菌素對馬-達二氏犬腎細胞MDCK內吞過程的影響,結果發現1 μg/mL的菲律賓菌素對病毒的內吞抑制率可以達到50%; 并且作者發現菲律賓菌素對流感病毒結合過程及與內吞膜融合均沒有抑制作用.因此他們推斷菲律賓菌素應該是影響了病毒的內化過程, 特別是抑制了小窩介導的內吞方式, 從而導致菲律賓菌素處理后的細胞內、病毒實現內吞比例的減少.

2.3.3 病毒以巨胞飲方式侵入細胞

巨胞飲作用是細胞非特異性攝取液體、溶質、膜、配體及吸附在質膜上的小顆粒物質的一種依賴肌動蛋白的內化方式. 在大多數類型的細胞中, 它不是持續進行的, 而是一個信號依賴的過程, 通常是在生長因子刺激的情況下發生, 例如血清中的生長因子能夠刺激細胞發生巨胞飲[47]. 攝取細胞外異硫氰酸熒光素FITC標記的可溶性葡聚糖(FITC-Dextran, Fdx) 進入大的內吞泡被認為是胞飲體存在的標志和形態學研究的常用方法. 研究人員將Fdx加入含血清的細胞溶液中, 發現了溶液中的血清能夠誘導Fdx進入內吞泡. 加入流感病毒后在更高的放大倍數下可見流感病毒共定位于含Fdx的內吞泡以及這些小泡的外部, 說明了流感病毒確實可以通過巨胞飲過程進入細胞[48]. 細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子P21活化激酶1(P21-activated kinase1, Pak1)是酪氨酸激酶信號通路的下游信號分子, 可激活許多不同的通路, 促進肌動蛋白網絡重排, 從而誘導巨胞飲作用;Epsin1是流感病毒網格蛋白介導內吞途徑中重要的適配體蛋白, 過表達Pak1顯性負突變體明顯抑制 IAV對細胞的感染, 同時過表達 Epsin1和Pak1的顯性負突變體更加減少病毒的感染, 表明球狀流感病毒同時利用網格蛋白和巨胞飲途徑侵入細胞[49]. 另一方面, 絲狀流感病毒由于尺寸的限制無法利用網格蛋白介導的方式進行內吞, 巨胞飲作用是它內吞的主要方式[49].

2.3.4 非網格蛋白非小窩方式的病毒內化

流感病毒侵入細胞的途徑是多樣化的, 除了上述幾種內吞方式外, 還存在不依賴網格蛋白不依賴小窩結構的途徑. Eps15是網格蛋白組裝過程中重要的調節蛋白, 過表達Eps15顯性負突變體可抑制網格蛋白介導的內吞. 但實驗結果顯示流感病毒可以侵入并感染表達突變體Eps15D95/295的細胞, 利用小窩結構的抑制劑并轉染顯性抑制的小窩蛋白1并不影響流感病毒感染細胞, 同時阻斷網格蛋白和小窩結構介導的內吞也仍然能造成細胞的感染, 由此確定流感病毒可以通過其他途徑, 即非網格蛋白非小窩的方式實現細胞內化[41].

另外有研究顯示流感病毒還可以通過脂筏介導的內吞途徑侵入細胞. 研究人員預先用甲基-b-環糊精作用A549細胞1 h去除膽固醇, 將處理后的細胞與流感病毒孵育, 結果顯示流感病毒結合并侵入細胞的數量急劇減少, 若流感病毒感染細胞2 h后再暴露于甲基-b-環糊精中卻不影響病毒對細胞的感染, 由此推斷流感病毒侵入細胞可能需要脂筏結構的參與, 但具體機制尚不明確[30].

2.3.5 誘導病毒內化的細胞因子

病毒的內化過程還需要其他特定的細胞信號分子的參與[50,51]. N-連接的糖蛋白就是其中一種[52].de Vries等[52]利用丟失N-連接糖基化作用的中國倉鼠卵巢癌細胞Lec-1進行實驗發現, 流感病毒與細胞表面的唾液酸結合后, 僅在有血清存在并且有N-連接糖蛋白協助的情況下IAV方可以侵入Lec-1細胞. 該現象顯示可能在N-連接的糖蛋白上存在一種特定的碳水化合物, 它是病毒侵入細胞的必需物質.

銜接因子相關蛋白復合體2 (adaptor related protein complex 2, AP-2)是一類適配體蛋白, 包括 AP2 A1, AP2 B1, AP2 M1, AP2 S1 四種亞基,可與內吞過程中多種蛋白質和脂分子發生作用. 其中, AP2 M1與含酪氨酸內化序列的膜結合受體胞內端作用; AP2 B1 在質膜靶向中發揮作用, 作為一個平臺招募其他功能相關的輔助蛋白如Eps15和Epsin1等[53]. 研究表明基因敲除其中的AP2 M1亞基后沒有改變IAV的內化動力學及侵入細胞的比例, 然而敲除AP2 B1亞基卻顯著抑制了流感病毒H5 N1的復制[54]. 另外有研究發現IAV與細胞表面的唾液酸結合后, 游離脂肪酸受體2 (free fatty acid receptor 2, FFAR2)結合至 HA1 的球狀頭部區域, 將 b-arrestin1 與 AP2 B1 聚集至質膜與FFAR2作用, 激活G蛋白偶聯受體激酶GRKs從而對FFAR2的C端磷酸化, 促進下游信號轉導幫助IAV通過網格蛋白的方式侵入細胞[54]. Epsin1是一類與網格蛋白、泛素蛋白及磷脂作用的蛋白.利用單病毒追蹤和活細胞成像技術, Epsin1被發現能夠與網格蛋白同時聚集到病毒結合位點, 通過形成CCPs侵入細胞[55]. 過表達缺乏泛素化結構域的Epsin1顯性負突變體幾乎完全抑制網格蛋白介導的IAV內吞, 這表明Epsin1主要通過泛素化結構域識別流感病毒在上皮細胞表面的受體從而啟動CCPs的形成, 最終導致病毒的內化[55].

核仁蛋白 (nucleolin, NCL)是一種普遍存在且含量豐富的蛋白, 參與細胞多種生理活動. 除了定位在細胞核, NCL也分布于核漿、細胞質及細胞表面. 已有研究證明NCL是呼吸道合胞體病毒感染過程中的功能型細胞受體[56]. 對于流感病毒,NCL可作用于H3 N2的非結構1蛋白使其定位于核仁[57,58]. 科學家分別用NCL抗體抑制細胞表面NCL蛋白的活性, 用純化的NCL蛋白阻斷PR8病毒, 用小干擾RNA敲除內源NCL蛋白的表達,然后結合病毒鋪覆蛋白印跡技術和免疫共沉淀技術檢測, 結果顯示以上操作均減少了流感病毒的內化, 這表明除了唾液酸, HA還可能特異性結合NCL蛋白參與病毒網格蛋白介導的內化過程[59,60].

C 型凝集素受體 (C-type lectin receptor, CLR)識別碳水化合物結構, 參與免疫細胞比如巨噬細胞和樹突細胞內病原體的吸收及抗原遞呈[61?63]. 如巨噬細胞甘露糖凝集素 (macrophage mannose lectin, MML), 巨噬細胞半乳糖型凝集素 (macrophage galactose lectin, MGL), 它們均表達一種碳水化合物識別結構域, 可以結合病毒或其他病原體上的甘露糖或半乳糖衍生物[64]. 研究表明MGL和MML可以作為IAV侵入小鼠巨噬細胞的受體[27,65].而另一種C型凝集素受體Langerin結構與之不同, 分為胞外結構域、跨膜區域及富含脯氨酸信號結構域的胞內端, Langerin胞內端脯氨酸信號結構域的缺失或是位點突變顯著抑制IAV對細胞的感染, 表明脯氨酸信號結構域參與了IAV的內化進程[32]. 已有研究顯示脯氨酸信號結構域與特定的Src同源結構域3作用, 參與膜泡轉運、細胞骨架運動、信號傳導及內吞等生理過程[66,67].

Ca2+信號通路也參與了IAV感染細胞的過程[68].當IAV結合至細胞表面時會刺激大鼠肉瘤蛋白 (rat sarcoma, Ras) 結合至磷脂酰肌醇–3 激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase, PI3 K), 隨后活化的 PI3 K調節IAV的CIE途徑. 另外還可以活化包括Ras同源基因家族成員 A (Ras homolog gene family,member A, RhoA)、Rho 相關激酶 (Rho-assocated kinase, ROCK)、磷脂酰肌醇 4-磷酸 5-激酶 (phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase, PIP5 K)、磷脂酶 C (phoapholipase C, PLC) 以及 Ca2+自身的新的正反饋電路參與CME途徑. 利用可穿過細胞膜的鈣螯合劑BAPTA-AM螯合Ca2+后抑制病毒的內化和感染, 抑制程度類似于同時使用MDC(抑制 CME) 和 LY294002 (抑制 CIE), 說明 Ca2+信號通路在CME和CIE介導的病毒內化過程中是必要的[68]. 有研究報道細胞膜上電壓依賴型鈣離子通道很可能介導因IAV刺激引起的胞內Ca2+的增加, 這可能是通過與第Ⅲ/Ⅳ片段上的天冬氨酸殘基的結合實現的[69].

另外, 有研究發現膜上脂筏結構也參與流感病毒的內化, 推斷可能是因為流感病毒與細胞接觸后刺激脂筏結構的形成, 為病毒的內化提供了信號平臺. 流感病毒接觸細胞后引起質膜區脂筏的聚集,當病毒的HA蛋白與脂筏上的唾液酸基團結合后激活表皮生長因子受體, 繼而活化下游信號分子如 PI3K 及磷脂酶 Cg1 (PLC-g1) 等, 促進流感病毒侵入細胞[70,71](表 2).

表 2 參與流感病毒內化的細胞因子Table 2. Cytokines involved in influenza virus internalization.

2.3.6 流感病毒侵入細胞后的過程

流感病毒通過不同方式內吞侵入上皮細胞后,新形成的包裹病毒的內吞泡都會進入“相同”的早期內吞體沿著微管蛋白進行轉運. 流感病毒從早期內吞體轉運至晚期內吞體-溶酶體區域后膜上M2蛋白質子通道打開, 將膜外的H+輸送至膜內,導致 pH下降[10,73]. 低pH誘導 HA構象改變, 暴露的疏水端融合HA蛋白亞基多肽HA2插入宿主內吞膜, 使兩種膜發生半融合, 病毒的vRNP復合物通過形成的融合孔釋放至細胞內[74], 宿主細胞的核輸入蛋白將病毒的vRNP通過核孔復合物輸送至核內, 利用RNA聚合酶及宿主因子合成mRNA和基因組RNA[75], mRNA出核進入細胞質, 并在游離的核糖體內翻譯產生蛋白質, 該蛋白質回到核內協助新的vRNP的合成. 細胞內的染色體區域穩定蛋白1及核輸出蛋白1介導vRNP的輸出[76].此外, 內質網的核糖體上合成的是病毒的包被蛋白 HA, NA, M2 蛋白, 經歷糖基化后通過高爾基體回到細胞膜[77]. 病毒的M1蛋白通過與細胞膜上帶負電的磷脂結合誘導其形成多聚體, 并與HA,NA或M2的胞內端作用[78]. 在病毒出芽位點, 細胞膜發生彎曲并包裹病毒基因組, 形成并釋放新的病毒顆粒[79]. 最后, 病毒的NA破壞唾液酸的連接從而釋放病毒.

3 SARS-CoV-2 的相關研究進展

3.1 冠狀病毒的結構特征

冠狀病毒是自然界廣泛存在的一大類病毒, 僅感染脊椎動物, 最早是從雞身上分離出來的. 冠狀病毒粒子直徑約為60—220 nm, 表面有3種糖蛋白: 刺突糖蛋白 (spike glycoprotein, S), 小包膜糖蛋白 (envelope glycoprotein, E), 膜糖蛋白 (membrane glycoprotein, M), 少數還含有血凝素糖蛋白(hemagglutinin protein, HE) (圖 3(a))[80]. 冠狀病毒的核酸為線性單股正鏈RNA, 5'端具有甲基化帽 狀 結 構 , 3'端 具 有 polyA 尾 , 類 似 于 真 核mRNA, 自身就可以發揮翻譯模版作用, 基因組全長27—32 kb, 是目前已知RNA病毒中基因組最大的病毒. 分析臨床樣品提取的病毒基因組序列發現典型的b屬冠狀病毒的特征包括: 5'端非翻譯區(UTR)、復制酶復合體 (orf1 ab)、S 基因、E 基因、M基因、N基因、3'端UTR, 還有一些未定義的開放閱讀框[81].

圖 3 SARS-CoV-2 的病毒結構 [80]及透射電子顯微鏡圖像[82] (a) SARS-CoV-2 的結構示意圖; (b), (c) SARS-CoV-2在不同放大倍數下的透射電子顯微鏡圖像Fig. 3. Structure[80] and transmission electron microscopy images[82] of SARS-CoV-2: (a) Structure of SARS-CoV-2;(b), (c) visualization of SARS-CoV-2 under transmission electron microscope.

2019新型冠狀病毒是冠狀病毒的一種. 2020年2月18日國際病毒分類委員會將新型冠狀病毒正式命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARSCoV-2). 世界衛生組織將由這一病毒導致的疾病命名為COVID-19. 研究人員從新冠患者肺泡灌洗液中分離出的SARS-CoV-2在電鏡下觀察一般為球形, 具有一定的多形性, 直徑約為 60—140 nm,表面帶有9—12 nm的刺突, 整體看上去類似日冕(圖3(b)和圖3(c))[82].

3.2 冠狀病毒的細胞表面結合與內化

冠狀病毒主要依靠包被上的S蛋白進行受體結合及病毒內化. 所有冠狀病毒的S蛋白都由3部分構成: 細胞外結構域、跨膜錨定結構域和短的胞內尾巴. 細胞外結構域包含兩個功能亞基, 受體結合亞基S1和膜融合亞基S2. S1又包含獨立的N端結構域 (S1-NTD) 及受體結合域 (RBD), 是進行受體識別及結合的關鍵蛋白[80]. 通過對SARSCoV-2受體配體結構域進行模擬分析, 研究人員發現其由一個核心子域及一個外部子域構成, 并且這個外部子域更類似于SARS-CoV; 盡管有些關鍵殘基存在差異, 但可推斷SARS-CoV-2與SARSCoV一樣, 也是利用血管緊張素轉化酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2) 作為細胞受體的[83]. Hoffmann等[84]繼而從實驗角度進行了驗證, 結果表明SARS-CoV-2-S選擇侵入 SARS-S侵入的細胞系, 兩者S蛋白受體結合域內含有相似的保守氨基酸序列, 并且提高hACE2抗血清濃度能夠阻止兩種S蛋白介導的病毒侵入, 這驗證了SARS-CoV-2利用S蛋白與細胞上ACE2受體結合的推斷. 此外, 通過對氨基酸序列的排列發現SARS-CoV-2的S蛋白存在1個缺失和3個插入位點, 4個多余的氨基酸PRRA插入S1與S2亞基之間, 可能會潛在影響S蛋白的水解. 為了證實以上推測, Wang等[85]利用生物信息學分析發現SARS-CoV-2的S蛋白在S1與S2亞基之間存在一個特殊的弗林蛋白酶剪切位點. 弗林蛋白酶普遍表達于多種器官和組織, 包括腦、肺、胃腸道、肝、胰腺及生殖系統. 弗林蛋白酶的預剪切可能促進后面依賴于絲氨酸蛋白酶(TMPRSS2)的入胞過程.當SARS-CoV-2感染細胞時, 主要通過TMPRSS2對S蛋白水解, 有些可能還需要半胱氨酸蛋白酶CatB/L的參與[84]. 研究表明TMPRSS2不僅參與冠狀病毒的蛋白水解, 在流感病毒H7 N9和H1 N1的感染中也發揮重要作用[86]. 冠狀病毒的S蛋白與流感病毒HA同屬Ⅰ型病毒融合蛋白, 在適當的蛋白水解裂解后, 二硫鍵結合亞基HA1和HA2形成同源三聚體. 作為參與其中的多種蛋白酶中的一種, TMPRSS2只裂解宿主細胞內新生的 HA, 而不參與侵入的病毒粒子HA的蛋白水解激活.

血管緊張素轉化酶ACE2定位于多種器官的質膜上, 利用細胞外區域執行功能并通過血管緊張素Ⅱ-1 型 受 體 (angiotensin II type 1 receptor,AT1 R) 誘導病毒侵入細胞, 隨后 ACE2 被降解[87].研究表明在SARS-CoV-2感染過程中, ACE2將血管緊張素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ) 降解為七肽血管緊張素1-7, 終止Ang Ⅱ的促炎癥反應, 同時Ang Ⅱ通過內吞作用和溶酶體降解誘導ACE2的細胞內吞[87]. 研究者通過希爾函數形式闡明S蛋白與ACE2結合的過程, 即位于細胞膜上的ACE2通常是與氨基酸轉運載體B0AT1結合, SARSCoV-2感染首先形成一種雜化三聚體, 由S1亞基的RBD結構域、ACE2蛋白和B0AT1組成[88], 說明SARS-CoV-2侵入細胞是通過受體介導的方式實現的.

對于SARS-CoV內吞機制的研究相對較多.早期研究認為SARS-CoV不依賴于pH即能感染細胞, 推斷其侵入可能是通過直接的膜融合來實現的[89]; 后來有研究表明SARS-CoV侵入細胞具有一定的pH依賴性[90], 需要內體蛋白酶CatB/L的參與[91], 暗示其可能采取內吞途徑. Inoue等[92]基于HepG2細胞的研究發現, SARS-CoV可以侵入caveolin-1陰性的HepG2細胞, 同時藥物氯丙嗪(一種網格蛋白依賴的內吞抑制劑) 和阻止網格蛋白重鏈表達的小干擾RNA皆能夠顯著抑制該侵入過程; 此外, ACE2與網格蛋白重鏈共定位于非脂筏區. 這些現象表明網格蛋白依賴的內吞途徑可能是SARS-CoV侵入宿主細胞的主要方式. 由于非洲綠猴腎細胞Vero E6具有相對較高的ACE2表達量, 因此它被廣泛應用于SARS-CoV相關的研究中. 例如Wang課題組[93]分別用b-甲基環糊精和菲律賓菌素作用于細胞提取膜內膽固醇, 結果顯示菲律賓菌素對SARS-CoV的內吞沒有影響,而b-甲基環糊精作用后病毒侵入被抑制且抑制效果呈藥物濃度依賴性; 同時, 雙色免疫熒光結果顯示SARS-CoV與caveolin-1并未發生共定位, 這暗示著b-甲基環糊精的抑制作用極有可能是通過改變膜脂質微區的完整性(而并非通過干擾小窩結構介導的內吞)來實現的, 進一步說明了小窩結構不一定參與SARS-CoV侵入細胞. 另外該研究還發現, 細胞松弛素D (一種抑制巨胞飲作用的藥物) 可以輕微地抑制病毒對Vero E6細胞的感染,同時SARS-CoV假病毒顆粒能夠誘導受體從細胞表面轉移至細胞內; 考慮到巨胞飲過程并不需要受體參與, 這說明巨胞飲也不應是SARS-CoV侵入Vero E6細胞的主要途徑; 然而氯丙嗪或者Eps15的顯性負性突變體不能阻斷病毒的侵入, 說明SARS-CoV能夠通過受體介導, 而不依賴于網格蛋白和小窩結構的方式實現內吞, 其間可能有脂筏結構的參與[93]. 總之, 針對SARS-CoV對細胞的侵入過程目前已經觀察到了網格蛋白介導的內吞、非網格蛋白非小窩結構介導的內吞、脂筏參與等多種可能的方式, 而SARS-CoV-2是否采用與SARSCoV類似的方式侵入細胞或者是否存在其他的途徑仍需進一步的研究[94].

4 總結與討論

本文從流感病毒的結構特征出發, 介紹了流感病毒感染細胞尤其是其在細胞表面鍵合并實現內化的過程. 流感病毒利用自身的HA, 與細胞表面糖蛋白或糖脂末端的唾液酸殘基、或磷酸化糖蛋白、C型凝集素Langerin、乃至脂筏結構等結合,之后在 Epsin1, AP2B1, FFAR2, 核仁蛋白等細胞因子及Ca2+通道、脂筏等結構的調制下, 激活特定的細胞信號通路刺激細胞進行內化. 細胞表面鍵合的流感病毒主要通過網格蛋白介導的方式實現內吞, 此外也存在巨胞飲作用、依賴小窩結構、或非網格蛋白非小窩介導等內化途徑, 侵入細胞后完成基因組復制和蛋白質表達從而組裝成新的病毒體.與流感病毒類似, SARS-CoV-2利用包被上的刺突蛋白S1與宿主細胞的ACE2受體結合, 需要細胞內的 TMPRSS2, AT1 R, Ang Ⅱ等蛋白的參與從而侵入細胞.

病毒是很簡單的生物, 但其與細胞相互作用的復雜途徑為理解病毒的細胞內化和感染過程帶來了巨大挑戰. 流感病毒與SARS-CoV-2都是通過配體受體相結合的方式吸附至細胞表面, 經細胞內蛋白水解酶的作用將HA和S蛋白活化形成兩個亞基, 分別負責病毒與宿主細胞的結合及介導膜融合過程. 流感病毒結合至細胞受體后需要多種細胞因子的參與才能實現內吞, 而有研究表明SARSCoV-2同樣可能利用細胞內的某些促吸附因子, 例如與細胞糖蛋白的結合, 來增強其感染性[84]. 這表明流感病毒與SARS-CoV-2在對細胞作用的機理上存在一些相似之處, 因此利用流感病毒的研究方法開展對SARS-CoV-2與細胞作用的研究是一條潛在的途徑, 這些方法包括利用siRNA技術或過表達顯性負突變體探究細胞內的蛋白在病毒感染中的作用, 利用單病毒跟蹤、定量活細胞成像和冷凍電鏡技術并結合改進的分析方法以實時追蹤病毒侵入細胞的過程等. 有效結合多種研究手段實現對病毒與細胞相互作用的深入了解, 將有助于開發出針對現有的及新出現的病毒性疾病的有效防御措施, 研發出針對宿主細胞關鍵功能的靶向藥物.這類以宿主為導向的藥物或抑制劑能夠發揮更加有效的病毒抑制效果, 并且不易導致耐藥性發生.