丹參通脈膠囊對腦缺血再灌注損傷大鼠的作用

蔣立勇，張鐵軍，馬淑媛，趙寧寧，王桂芝，蘇謙，鐘延法，李林林，王東蕾

(1.新泰市中醫醫院，山東 新泰 271200；2.威海市文登區米山鎮衛生院，山東 文登 264424；3.膠州市人民醫院，山東 膠州 266300；4.山東省千佛山醫院，山東 濟南250014；5.德州市中醫院，山東 德州253013)

近年來，如何減輕腦缺血再灌注損傷(CIRI)[1]是腦缺血疾病的研究重點，化學藥物如鈣離子拮抗劑，自由基清除劑，以及神經保護劑等可用于治療CIRI，但是，用藥后出現的一系列不良反應如胃腸道反應，腦出血等超出了臨床長期治療所帶來的治療效果[2]。近年來，臨床應用和實驗報道中藥成分在治療CIRI方面具有很大的優勢，中藥以其多藥效、多靶點、多環節作用成為研究的一個熱點[3-5]。

丹參通脈膠囊由丹參、三七、水蛭、三酮(葛根黃酮、 銀杏葉黃酮、山楂葉黃酮)、牡丹皮、芍藥等藥物組成，具有益氣活血、通經活絡、疏肝解郁的功效。課題組前期研究發現，丹參通脈膠囊對大鼠腦神經細胞結構具有保護作用，也未出現蓄積中毒癥狀，這表明，丹參通脈膠囊具有良好的臨床應用潛力，有望進入臨床研究。本研究通過構建大鼠腦缺血再灌注損傷模型，以血塞通為陽性對照，研究探討丹參通脈膠囊對腦缺血再灌注大鼠腦組織恢復程度，對腦損傷保護作用機制，為開發新的神經保護藥提供實驗基礎，為其進一步應用于臨床提供依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SD大鼠40只，SPF 級，體重220～250 g，雌雄各半，由山東省動物中心提供，許可證號：SDCK20090001。

1.2 實驗藥物及制備 丹參通脈膠囊由山東省中醫藥研究院提供；藥物組成：丹參、三七、水蛭、三酮(葛根黃酮、 銀杏葉黃酮、山楂葉黃酮)、牡丹皮、芍藥等。制備：實驗前將丹參通脈膠囊制成52 mg·mL-1濃度的懸濁液。血塞通片，由云南特安吶股份有限公司生產，批號：200206193742，規格: 50 mg/片；制備：實驗前將血塞通片制成28 mg·mL-1濃度懸濁液，4 ℃保存，備用。

1.3 主要試劑與儀器 水合氯醛(上海中國白鶴化工廠)；栓線(北京西濃科技有限公司)；激光多普勒組織血流儀[型號:Peri Flux 5000，Perimed AB帕瑞醫學科技(北京)有限公司]；烤箱DGX-9003B(上海福瑪實驗儀器有限公司)；醫用低溫電冰箱(日本日立公司)；電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫療器械廠)；圖像分析軟件(Image J)；倒置熒光顯微鏡 Nikon Eclipse TI-SR、成像系統 Nikon DS-U3(日本尼康)。

2 實驗方法

2.1 缺血再灌注動物造模(MCAO) 術前1周，大鼠自由飲水及進食。稱重后將大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，仰臥固定，頸去毛消毒，于頸部正中開始切開并逐層分離，先分離右側頸總動脈(CCA)，再分離頸內(ECA)、頸外動脈(ICA),結扎右側CCA近心端、及其所有分支動脈,分離右側ICA，并沿著ICA結扎翼顎動脈(PPA)，在ECA近端備線，用動脈夾夾閉其遠端，在CAA分叉處做一切口，插入尼龍線，推進時感阻力，表明栓線頭部到達大腦中動脈(MCA)起始部，阻斷同側大腦中動脈所有血供來源，外留約長的1 cm線頭，縫合手術切口，完成一側造模。缺血2 h后，輕拉線頭至有阻力，提示尼龍線頭部到達頸總動脈切口處，從而建立缺血再灌注模型。假手術組大鼠除不插線外，其余步驟同上。

2.2 分組及給藥 實驗大鼠用隨機數字表法分為假手術組、模型組、血塞通組及丹參通脈膠囊組，各10只。大鼠大腦中動脈再灌注手術缺血2 h后，給丹參通脈膠囊組大鼠進行52 mg·mL-1濃度的懸濁液灌胃[1 mL·(100 g)-1]，qd。血塞通組大鼠進行28 mg·mL-1濃度懸濁液灌胃[1 mL·(100 g)-1]，qd。假手術組及模型組予等量生理鹽水灌胃。

2.3 神經行為學評分 造模24 h后觀察存活大鼠行為變化，評分標準參考ZeaLong分制[6]。5分制，得分越高說明大鼠神經損傷導致的行為障礙越嚴重：0分，行為正常，未見損傷癥狀；1分，對側前爪不能完全伸展；2分，向外側不停轉圈；3分，對側傾倒及不能站立；4分，不能行走，喪失意識；5分，死亡。

2.4 腦組織含水量及腦梗死體積測定 造模24 h后先稱濕重，置烤箱內，后稱干重，按如下公式計算腦組織含水量：腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%；造模24 h后梗死區拍照輸入計算機，用Image J軟件計算梗死面積，及梗死區占整個腦組織的百分比。

2.5 局部腦組織血流量(rCBF)的測定 用激光多譜勒血流儀檢測大鼠實驗前、缺血再灌注24 h后局部rCBF的變化。測量的血流量結果均以灌注單位 PU(Perfusion Unit)為單位。本研究中使用的PeriFlux 5000可測得以下參數：血流灌注量PU，移動血細胞濃度(CMBC)，回光總量(TB)和速率，血流灌注量=監測體積內CMBC×速率。

2.6 血管內皮細胞增殖數目的測定 用免疫熒光染色法檢測缺血局部腦皮質微血管內皮細胞數目變化情況，在高倍熒光顯微鏡下，計算缺血皮質中ki67標記的陽性細胞數，并計數平均值。

3 實驗結果

3.1 對大鼠行為的影響 假手術組大鼠均無異常癥狀，行為評分為0分。與模型組相比，丹參通脈膠囊組、血塞通組行為學評分顯著降低(P<0.01)，與血塞通組比較，丹參通脈膠囊組行為學評分改善情況降低更明顯，差異有顯著性意義(P<0.01)，結果見表1。

表1 神經行為學評分

3.2 對大鼠腦組織含水量及梗死體積的影響 與模型組比較，丹參通脈膠囊組、血塞通組均可明顯降低大鼠缺血再灌注損傷腦組織含水量(P<0.01)。與血塞通組比較，丹參通脈膠囊組腦組織含水量顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，丹參通脈膠囊組、血塞通組均可縮小缺血側腦梗死體積(P<0.01)，且丹參通脈膠囊組腦梗死體積顯著降低(P<0.01)，結果見表2。

表2 腦組織含水量及梗死體積

3.3 各組大鼠實驗前后缺血局部腦皮質血流量(rCBF)的比較 模型組和藥物組大鼠實驗后rCBF較實驗前均有不同程度降低；實驗后，與模型組比較，丹參通脈膠囊組、血塞通組rCBF灌流多(P<0.01)，丹參通脈膠囊組優于血塞通組(P<0.01)，結果見表3。

表3 各組大鼠實驗前后rCBF的比較

3.4 各組大鼠缺血腦皮質ki67陽性表達比較 熒光顯微鏡下見：假手術組僅見極少量微血管內皮細胞增殖，與模型組比較，丹參通脈膠囊組、血塞通組大鼠腦皮質的微血管內皮細胞增殖數目均有增加，(P<0.01)，與血塞通組比較，丹參通脈膠囊組增加更明顯(P<0.01)，結果見表4。

表4 各組大鼠缺血腦皮質ki67陽性表達比較

4 討論

腦缺血再灌注可挽救瀕臨梗死的細胞，另一方面，研究顯示缺血區恢復再灌注會加重細胞損傷而導致其死亡，加重腦組織損傷，出現更嚴重的腦功能障礙，我們稱之腦缺血再灌注損傷(CIRI)[1]。已知腦缺血后的數秒即可發生腦組織級聯損傷，故恢復再通梗死組織缺血半暗帶，阻止其發展為不可逆性缺血性損傷是目前研究的熱點。

大鼠神經行為學評分可直觀反映機體的運動障礙程度。腦水腫程度與腦組織含水量增加的多少有關[7]，腦水腫的發生使顱內壓增高，影響腦循環機能，加重腦組織損傷。腦梗死體積測定是評估藥物對缺血再灌注腦組織起到保護作用的最直接手段[8]，而腦梗死面積的減少是以梗死區域供血改善為前提的。本次實驗顯示，丹參通脈膠囊能有效地減輕因缺血再灌注導致的大鼠神經行為障礙；腦含水量降低，可減輕腦水腫，改善微循環；減小梗死面積，對大鼠局灶性腦缺血具有神經保護作用。

缺血局部腦組織血流量的減少是腦缺血后最直接的表現，又是引起腦組織損害的最根本的原因，腦缺血中心區域殘留腦血流量小，不超過1 h 就發展為不可逆腦損傷[8]。由于長時間血液不能灌流，導致血管內皮的膜磷脂大量降解，血管舒縮功能下降，管壁腫脹及塌陷，對大分子物質通透性增加，梗死灶水腫加劇，使供血重建更加困難。因此第一時間挽救受損組織，盡快恢復缺血半暗帶區的血流供應，須增加局部血流量。結合本次實驗對rCBF的檢測結果證實：缺血后局部腦皮質血流恢復得越快，對局部組織的損害最少，而丹參通脈膠囊可增加缺血腦組織的血流灌注量，改善缺血腦組織的供血，加快缺血半暗帶的恢復。

急性腦缺血后無論是神經元、局部腦組織微血管都會受到缺血、缺氧的影響而出現不同程度損傷，最先出現損傷的是血管內皮細胞。而藥物是否能在腦缺血急性期恢復血管內皮細胞損傷，加快腦組織恢復，對神經功能恢復起至關重要的作用。Ki67是一種存在于增殖細胞中的核抗原，其半衰期為1 h或更短，陽性表達覆蓋整個有絲分裂期，被認為是一種最準確可靠的檢測細胞增殖狀態的方法。而免疫熒光Ki67可以明確腦缺血后腦組織血管內皮細胞增殖情況[9]。故本實驗采用Ki67檢測指標，觀察丹參通脈膠囊對血管內皮的影響。研究結果表明，丹參通脈膠囊對于局灶性腦缺血而言，可有效增加腦缺血再灌注大鼠局部腦皮質微血管內皮細胞的數量，減輕局部腦組織損傷。

腦缺血再灌注屬于中醫“卒中”范疇，基本病機為瘀血阻絡，治療當以活血通經為主。分析丹參通脈膠囊主要藥理成分，其中三七三醇皂苷可抑制血小板聚集、改善腦缺血大鼠的神經行為，縮小腦梗死面積，減輕腦神經元結構損傷[10]。Shi等[11]通過體內和體外實驗研究了三七總皂苷通過調節 NgR1/RhoA/ROCK2信號通路發揮保護神經作用機制。水蛭具有改善腦內循環、抑制血小板聚集、保護腦細胞等功能。大量臨床研究表明，中藥黃酮類化合物對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其作用機制主要有抗氧化、抗炎、抗凋亡、改善血腦屏障通透性和血液流變學等[12-13]。丹參中的丹參素可改善血液循環，減輕腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷，減少神經細胞凋亡[14]。大量實驗研究表明川芎嗪對神經損傷具有較好的治療作用，發揮作用的機制與減少興奮毒性、調節鈣通道、抗自由基等有關[15]。

綜上，丹參通脈膠囊能促進大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織恢復：降低行為學評分，明顯改善大鼠的神經行為功能，減少腦水腫程度及腦梗死體積，減輕大腦結構破壞，提高腦缺血再灌注大鼠局部腦組織血流量，增加缺血再灌注后局部腦皮質微血管內皮細胞的數量以促進微血管新生。表明丹參通脈膠囊對大鼠缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用，加速腦組織恢復。