輪作和有機肥對濱海灰潮土土壤微生物種群的影響

陳余平，鄭華章，周飛，胡鐵軍

(余姚市農業技術推廣服務總站，浙江 余姚 315400)

微生物是土壤生態系統中最活躍的組成部分，是土壤養分循環的重要驅動力。土壤微生物群落結構、生物量等可以反映土壤質量與土壤肥力的演變趨勢，常被用作評價土壤健康的重要指標[1]。土壤微生物，特別是細菌群落的多樣性在土壤生態系統營養元素的循環、植物病蟲害防治，及土壤肥力的保持等方面發揮著重要的作用。耕作方式和作物類型的變化均會改變土壤微生物群落特征[2]，因此，選擇合理的栽培措施，調節土壤微生物群落組成是保障現代農業穩產高產和作物安全的重要舉措之一。施肥會直接或間接地改變農田生態系統的養分平衡與供應狀況，進而影響土壤的物理、化學、生物學特性。研究發現，施用有機物料能顯著提高土壤微生物量和菌群數，但對不同菌群的影響程度有所差異[3-4]。從生產實踐上看，明確不同種植制度、土地利用狀況，以及特定土壤類型下施用有機肥對土壤生物學性狀的影響，對于農田土壤培肥、養分資源的高效利用等均具有現實意義。針對浙江省濱海圍涂區域的種植結構和施肥現狀，以余姚市濱海灰潮土為研究對象，設計連續3 a的定位試驗，引入生物高通量測序技術，考查不同輪作和施用有機肥處理條件下土壤微生物種群的變化情況，以期為農業種植結構調整、土壤地力培肥提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 試驗概況

試驗在余姚市小曹娥鎮佳云西蘭花專業合作社進行。試驗地塊屬于典型的加工蔬菜種植區，供試土壤為濱海灰潮土，進行連續3 a的包含輪作和施用有機肥處理的大田裂區試驗。各處理的輪作方式和有機肥施用情況簡述如下：T1，春、秋、冬均種植綠花菜，不施用商品有機肥；T2，春綠花菜-單季晚稻，年商品有機肥施用量7 500 kg·hm-2；T3，春綠花菜-單季晚稻，不施用商品有機肥；T4，冬綠花菜-早稻，年商品有機肥施用量7 500 kg·hm-2；T5，冬綠花菜-早稻，不施用商品有機肥；T6，冬綠花菜-菜用大豆，不施用商品有機肥；T7，雪菜-四季豆-單季晚稻，年商品有機肥施用量7 500 kg·hm-2；T8，雪菜-四季豆-單季晚稻，不施用商品有機肥；T9，雪菜-四季豆-夏玉米，不施用商品有機肥。

1.2 樣品采集

試驗共進行3 a，于2019年11月中旬最后一茬作物收獲后采集土壤樣品。各小區以“S”形8點采集耕層土壤，混為一個土樣，用冰盒保存，并迅速帶回實驗室。剔去植物根系、可見動物殘體和石粒等，均勻混合，平鋪，取5點，放入樣品試管中。每個土壤樣品取樣3～5 g，然后由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行土壤微生物群落多樣性測序和交互式分析。

1.3 測定方法

土壤細菌群落由16S rRNA測序，引物為338F_806R；真菌由18S rRNA測序，引物為ITS1F_ITS2R。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA基因組純度。PCR擴增，采用TransGen AP221-02：TransStartFastpfuDNA Polymerase試劑盒，20 μL反應體系，在ABI GeneAmp?9700型PCR儀上進行。采用Miseq測序系統測序。

1.4 數據統計

利用Usearch (version 7.1)軟件，將測序分析結果聚類為用于物種分類的OTU(操作分類單元)，并對所有樣品進行抽平。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，將置信度閾值設為0.7，選用Silva(Release128 http://www.arb-silva.de)數據庫得到分類學信息。利用Mothur(version 1.31.2)軟件進行α多樣性分析，經Rank-Abundance曲線分析，證實物種豐富度和群落均勻度符合要求。經群落組分析，得相對豐度。利用FUNGuild預測分析真菌物種功能性。

2 結果與分析

2.1 輪作對濱海灰潮土土壤微生物種群的影響

經連續3 a的旱旱、水旱輪作后，基于土壤樣品檢測分析數據，具體考查T1和T3(第1組)、T6和T5(第2組)、T9和T8(第3組)等3組輪作方式下濱海灰潮土土壤微生物種群的變化情況。

2.1.1 多樣性分析

細菌、真菌的豐富度實際觀測值(Sobs值)代表土壤樣本中微生物物種的豐富程度，也可理解為微生物物種的數量。經Miseq測序、α多樣性分析，3 a輪作后試驗各處理細菌、真菌的Sobs值變化情況如表1所示。可以看出：經連續3 a水旱輪作(T3、T5、T8)后，相應組別下土壤微生物中的細菌物種要比旱旱輪作(T1、T6、T9)的豐富，高出5.90%～16.16%。對于真菌而言，除T1與T3處理的Sobs值相近外，其余2組也同樣表現為水旱輪作后土壤微生物中的真菌物種要比旱旱輪作后的豐富。這是因為水旱輪作模式下淹水狀態的微生物總數、細菌、放線菌數量高于濕潤狀態[5]。試驗結果表明，水旱輪作比旱旱輪作有利于豐富土壤微生物的物種多樣性，有助于增加土壤的微生物量碳、氮，進而提高土壤肥力。

表1 輪作條件下濱海灰潮土土壤細菌、 真菌的Sobs值

2.1.2 群落組成分析

在門分類學水平上統計各樣本的物種豐度。經3 a連續輪作后檢測分析采集的土壤樣品，保留累計豐度在97%以上的群落組成，得到18個門的細菌種群和11個門的真菌種群。各處理18個門細菌種群的豐度變化如圖1所示：第1～3組中，水旱輪作后土壤中的綠屈撓菌門、藍細菌門、Patescibacteria、WS2豐度較旱旱輪作下增加，放線菌門、厚壁菌門、Rokubacteria豐度下降(降幅3.28%～46.19%)。各處理11個門真菌種群的豐度變化如圖2所示：從旱旱輪作改為水旱輪作后，所有組別相應土壤的絲孢菌門豐度均下降(降幅6.88%～75.27%)；在第1組和第3組中，從旱旱輪作改為水旱輪作后，隱真菌門、絲足蟲類和未經分類的真菌豐度值均增加，而子囊菌門、擔子菌門的豐度值下降。

圖1 輪作條件下濱海潮土的細菌豐度

圖2 輪作條件下濱海潮土的真菌豐度

不同的輪作方式，會導致土壤微生物種群比例發生變化。土壤微生物種群豐度值上升，說明這種輪作方式適宜于該種群的生長，反之則不利于該種群的生長。水旱輪作轉換過程中水分的變化可調控土壤中某些細菌種群的數量，特別是能促進較適應惡劣環境的光異養細菌的生長，但對好氧的細菌和腐生菌卻有抑制作用。水旱輪作對真菌(被孢霉門除外)的影響不盡一致。本研究3組處理中水稻的種植季節不同：1個是種早稻，另外2個是種單季晚稻。對比3組處理中早稻與晚稻季門水平上細菌與真菌的豐度變化，發現細菌豐度變化表現一致的數量要多于真菌，這說明真菌對土壤水分變化的敏感性要高于細菌。

2.1.3 真菌的FunGuild功能分類統計

FunGuild基于目前已發表的文獻或權威網站數據庫，根據營養方式將真菌分為病理營養型、共生營養型與腐生營養型3大類。如表2所示，旱旱輪作改為水旱輪作后，病理營養型土壤真菌數量顯著降低，共生營養型真菌數量有所下降，而腐生營養型真菌數量明顯上升。這說明水旱輪作在一定程度上有助于減少農作物病蟲害。

表2 輪作條件下濱海灰潮土土壤真菌 FunGuild分類

2.2 施用有機肥對濱海灰潮土土壤微生物種群的影響

在旱旱或水旱輪作一致情況下，分析連續3 a施用商品有機肥(T2、T4、T7)和不施用有機肥(T3、T5、T8)對濱海灰潮土土壤微生物種群的影響。以T2和T3對比作為第4組，T4和T5對比作為第5組，T7和T8對比作為第6組。

2.2.1 多樣性分析

經Miseq測序、α多樣性分析，各處理細菌、真菌的Sobs值如表3所示。可以看出，連續3 a施用有機肥處理的土壤中細菌物種更豐富。對于真菌而言，除第6組外，施用有機肥處理的土壤中真菌物種也更豐富。這說明施用有機肥有利于增加土壤中微生物的多樣性。

表3 施用有機肥對濱海灰潮土土壤細菌、 真菌sobs值的影響

2.2.2 群落組成分析

經3 a連續不同施肥處理后，檢測分析采集的土壤樣品，保留累計豐度在97%以上的群落組成，得到18個門的細菌種群和11個門的真菌種群。各處理18個門類細菌種群的豐度變化如圖3所示：連續施用有機肥后，土壤中的厚壁菌門、Entotheonellaeota豐度增加(增幅1.25%～67.47%)，酸桿菌門、疣微菌門、WS2豐度下降(降幅1.72%～584%)。各處理11個門類真菌種群的豐度變化如圖4所示：連續施用有機肥后，土壤中的子囊菌門、擔子菌門、絲孢菌門豐度增加(增幅0.66%～521.16%)，油壺菌門和未經分類的真菌豐度下降(降幅3.16%～39.31%)。

圖3 施用有機肥對濱海灰潮土細菌豐度的影響

圖4 施用有機肥對濱海灰潮土真菌豐度的影響

可以看出，施用有機肥并不是對所有微生物都是有利的。雖然有機肥為土壤微生物提供了豐富的營養，但是在土壤環境的局限下土壤微生物之間存在競爭，有機肥的施用更有利于腐生型微生物的繁殖[6]，而對于寄生型微生物則會起到抑制作用。

2.2.3 真菌的FunGuild功能分類統計

對各組處理真菌的OTU檢測值在FunGuild上進行檢索分析，結果如表4所示。連續3 a施用有機肥后，各處理土壤中3類營養型的真菌OTU數值變化并不一致，從總體趨勢上看，施用有機肥更有利于腐生營養型真菌的生長，其次是共生營養型，再次為病理營養型。因此，連續多年施用有機肥料，既有利于各類營養型真菌的富集，但也存在加劇土傳病害的風險。

表4 施用有機肥對濱海灰潮土土壤 真菌FunGuild分類的影響

3 小結與討論

水旱輪作與施用商品有機肥均能增加土壤微生物物種的豐富度，也能引起土壤微生物菌群結構的變化。本研究基于3 a定位試驗，通過微生物高通量測序技術初步明確了余姚市濱海灰潮土土壤微生物種群群落結構變化。試驗結果表明，輪作和施用有機肥均增加了土壤中細菌、真菌的豐度。在輪作條件下，真菌種群變化較細菌更多。在輪作時要關注土壤水分變化，在水旱輪作與旱旱輪作的比較中，土壤水分變化不僅影響光異養型細菌生長，還對好氧細菌和腐生型細菌有抑制作用。真菌較細菌對水分的變化更敏感。水旱輪作條件下：當種植水稻時，腐生營養型真菌增加，而共生營養型真菌被抑制；當種植旱地作物時，情況則迅速改變。此外，連續多年施用商品有機肥有利于腐生型微生物的繁殖生長。