小鼠生物法與ELISA法對腹瀉性貝類毒素的檢測比較

杜偉，張曉輝，孔蕾，王鼎南，鄭重鶯*

(1.浙江省海洋監測預報中心，浙江 杭州 310007； 2.浙江省海洋科學院，浙江 杭州 310010； 3.浙江省水產技術推廣總站，浙江 杭州 310023)

赤潮(red tides，國際上也稱有害藻華harmful algal blooms)是指在一定環境條件下，海洋生物(以單細胞藻類為主)迅速增殖或積聚而產生的一種海水變色的自然現象[1]。赤潮發生時，區域海洋生態系統失衡，赤潮優勢種優勢度明顯，群落中海洋生物多樣性明顯降低；在赤潮消亡期，大量赤潮生物降解過程在短時間內急劇消耗所在海域中的氧氣，造成異養生物因缺氧而死亡，進而對區域海洋環境和生物、海洋漁業資源、水產養殖業及濱海旅游業等產生不利影響，如引發赤潮的海洋生物為有毒赤潮藻，其產生的貝類毒素通過食物鏈不僅影響區域海洋生態系統的結構、功能和穩定性，還有可能威脅海洋食品安全，人類誤食含有貝類毒素(赤潮藻毒素)的食品時可能中毒，嚴重者有死亡風險。近些年全球赤潮一直處于高發狀態，而我國近岸海域赤潮也處于高發狀態，且近年時有人類誤食含赤潮藻毒素的貝類而發生中毒或疑似中毒的報道[2-4]。

腹瀉性貝類毒素(diarrhetic shellfish poisoning，DSP)是在世界范圍內廣布并引起人類中毒較多的一類赤潮藻毒素[5]，具有相對熱穩定性，日常方式加熱很難使其降解或使毒性減小，且該毒素在貝類肌肉和內臟中分布情況沒有明顯差異，很難通過去除內臟等方式減少食用DSP引起中毒的概率。它是一類聚醚類或大環內酯類化合物，脂溶性，其結構復雜，化學性質穩定，能夠在貝類等海洋生物體內積累(富集)、降解，甚至有些毒素可在貝類體內進行轉化[6]。根據結構特征，一般將常見DSP分為3大類，其中常引起人類中毒的種類為酸性成分的大田軟海綿酸(okadaic acid，OA)及其天然衍生物鰭藻毒素(dinophysistoxins，DTX 1～3)，而中性成分的扇貝毒素(pectenotoxins，PTXs)、其他成分的蝦夷扇貝毒素(yessotoxins，YTXs)及45-羥基扇貝毒素則比較少見?？僧a生腹瀉性貝類毒素的有毒赤潮藻主要為海洋甲藻，如鰭藻(Dinophysisspp.)、原甲藻(Prorocentrumspp.)等[7]。

作為生物毒素，DSP的致毒機理比較復雜，一般認為其活性成分軟海綿酸可抑制哺乳動物血液細胞質中的蛋白質磷酸酶的活性，導致蛋白質去磷酸化過程受到抑制，進而影響消化道、肝臟等器官功能，最直觀的表現有惡心、嘔吐、腹瀉等[8]。小鼠試驗表明，DSP對其毒性可作用于肝臟、心肌等器官，同時還具有致畸、致突變作用[9]。另外，DSP對人和動物的致毒影響可能有疊加效應，多次低濃度、亞慢性中毒可能會增加其對中毒者健康的危害。

隨著檢測技術的進步，開發出多種對DSP的檢測方法，包括小鼠生物法、色譜法、色譜質譜聯用法、電泳法、免疫學檢測技術、細胞毒性檢測技術等，其中免疫學檢測技術在實踐中常用的為酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，《食品安全國家標準 貝類中腹瀉性貝類毒素的測定》(GB 5009.212-2016)中增加了酶聯免疫吸附法作為食品國家標準方法[10]。本文比較了小鼠生物法與ELISA法檢測樣品中DSP含量的差異，旨在為一線檢測人員測定水產品中DSP含量提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用竹蟶、紫貽貝、厚殼貽貝、蛤蜊購自浙江省水產碼頭海鮮市場。試驗用小鼠為ICR系雄性小鼠，體重18～20 g；腹瀉性貝類毒素檢測試劑盒(品牌為ABRAXIS)；腹瀉性貝類毒素標準品OA(軟海綿酸，純度99.5%，加拿大國家研究院海洋研究所)。其他試驗用試劑均為分析純，試驗用水為去離子水。

試驗設備與量器。酶標儀，精度為0.01 g的電子天平，機械秒表及其他實驗室常用儀器設備與量器等，所有需要計量的設備和量器均在有效期內。

1.2 樣品處理與制備

取購自水產市場的竹蟶、紫貽貝、厚殼貽貝及蛤蜊，用自來水充分洗凈貝類外殼，打開外殼，用自來水淋洗貝類外殼內部以去除泥沙及其他外來雜質，用鑷子取出貝肉，用去離子水洗凈取出的貝肉，然后瀝水10 min，挑揀出貝肉中碎殼等雜物，用均質器將貝肉均質備用。

竹蟶加標樣品處理。分別取往年實驗室檢測任務中竹蟶DSP陰性樣品10份，每份500 g，將貝肉座均質化處理，1份作為陰性控制樣，其余9份陰性樣品分別加入配制好的DSP含量為175.00、150.00、125.00、100.00、50.00、25.00、10.00、5.00、4.00 μg的標準溶液，震蕩1 min，制成竹蟶加標樣1～9。

1.3 小鼠生物測定法

從已均質好的貝類樣品中提取DSP和小鼠生物法試驗參照GB 5009.212—2016《食品安全國家標準 貝類中腹瀉性貝類毒素的測定》第一法 小鼠生物法執行[10]，所有樣品做平行樣。小鼠生物法檢測DSP含量檢出限為50 MU·kg-1。

1.4 ELISA法測定

取1.00 g均質后的竹蟶、紫貽貝、厚殼貽貝、蛤蜊、竹蟶陰性樣品或竹蟶加標樣品于干凈離心管中，加入甲醇溶液(V∶V為8∶2)10 mL，充分振蕩，將混合液于4 000 r·min-1離心10 min，取上清液200 μL，用樣品稀釋緩沖液稀釋到2.0 mL，振蕩1 min；取上步驟樣品溶液100 μL，待測。所有樣品做平行樣測定。

按照試劑盒自帶的說明書操作ELISA法檢測程序，根據本試驗樣品提取、提取液稀釋倍數及試劑盒本身的最低檢出限值，確定本試驗ELISA法檢測DSP的檢出限為10 μg·kg-1，滿足GB 5009.212—2016第二法 酶聯免疫吸附法的規定[10]。

1.5 定量計算

試驗結果按GB 5009.212—2016[10]中規定的計算方法定量計算，其中小鼠生物法計算結果值(MU·kg-1)、ELISA法計算結果值(μg·kg-1)。本試驗對于OA的檢測結果等同于對DSP的檢測結果。根據西太平洋地區DSP毒力經驗值，按照1 MU(OA)=4 μg(OA)將小鼠生物法檢測結果單位進行換算成μg·kg-1。

平行樣的處理方式。檢測結果均為陽性時，DSP含量取算數平均值；檢測結果均為陰性時，DSP含量報未檢出；平行樣中1個檢測結果為陽性、1個結果為陰性，則陰性檢測結果按照檢出限的1/2參加計算，即樣品中DSP含量檢測結果為陽性樣品結果值和檢出限1/2值的算數平均值。

加標樣檢測結果和加標回收率修約規則。檢測結果按照“四舍六入五留雙”規則修約至整數，加標回收率按照“四舍六入五留雙”規則保留3位有效數字。

在園林景觀的設計中，園林植物配置應與周邊環境氛圍相結合，例如，學校的景觀設計，應根據學校的環境，選擇桃樹和李樹作為主要樹種，如紫葉李、桃樹等，以頌揚教師默默耕耘、無私奉獻的精神；政府機關的設計應根據政府機關的環境景觀特點，選擇荷花和竹子作為主要樹種，以表達公務員出淤泥而不染、全心全意為人們服務的精神；居住區的景觀設計應根據居住區的環境景觀特色，選擇柏樹和梧桐樹作為主要樹種，以代表人們的高潔莊嚴、長壽無疆的寓意。

2 結果與分析

由表1可知，ELISA法和小鼠生物法均可用于對貝類樣品中DSP含量進行檢測。

采用小鼠法檢測，試驗中竹蟶、紫貽貝、厚殼貽貝、蛤蜊、竹蟶陰性等樣品，以及竹蟶加標樣品4～9等樣品檢測結果為陰性，即沒有檢出樣品中含有DSP；試驗中竹蟶加標樣品1檢測結果為陽性；試驗中竹蟶加標樣品2和3，其均有1個平行樣檢測結果為陰性，相對應的平行樣檢測結果為陽性，按照本試驗對于平行樣檢測結果的處理方式，竹蟶加標樣品2和3的檢測結果為陰性。

表1 不同檢測方法對DSP含量的影響

采用ELISA法檢測，試驗中竹蟶加標樣品1～8檢測結果為陽性，其他樣品檢測結果均為未檢出，加標樣品1～8的檢測結果加標回收率為84.0%～100%，滿足實驗室ELISA法加標回收率(70.0%～120%)的要求。

根據試驗結果，檢測貝類樣品中DSP含量時，樣品中DSP含量在300 μg·kg-1以上時，2種檢測方法均為陽性，但2種檢測方法結果有差異；樣品中DSP含量在200～300 μg·kg-1時，ELISA法可準確檢測樣品中DSP含量，而小鼠生物法可出現假陰性反應；樣品中DSP含量在10～200 μg·kg-1時，利用小鼠生物法無法檢測樣品中DSP含量，而ELISA法可準確檢測樣品中DSP；在DSP陰性樣品中兩者檢測結果一致。

綜上，對于陰性樣品及DSP加標量在10 μg·kg-1以下的貝類樣品，小鼠生物法和ELISA法檢測結果均為陰性。對于DSP加標量在10～200 μg·kg-1的竹蟶加標樣品，小鼠生物法無法檢測到樣品中的DSP，而ELISA法檢測結果為陽性，且其檢測值以加標回收率計算，滿足試驗要求。

3 小結與討論

本試驗主要對小鼠生物法和ELISA法檢測貝類中DSP含量做了比較研究，試驗結果表明,貝類中DSP含量處于不同濃度水平時，兩種檢測方法的檢測存在差異。

貝類中DSP含量在10～200 μg·kg-1時，ELISA法可以準確檢測貝類中DSP含量，而小鼠生物法的檢測結果為未檢出，這跟小鼠生物法的檢出限(0.05 MU·g-1，等同于200 μg·kg-1)偏高有關，說明小鼠生物法無法檢測到低濃度水平的DSP。

貝類中DSP含量在10 μg·kg-1以下時，兩種檢測方法的檢測結果一致。

正常情況下，在方法檢出限以上，通過對貝類樣品提取液進行合適倍數稀釋，利用ELISA法和小鼠生物法對貝類樣品DSP含量檢測時能得到吻合度較好的結果；但從檢測方法原理上分析，小鼠生物法檢測結果會略高于ELISA法檢測結果。究其原因，在提取充分前提下，利用小鼠生物法檢測毒性試驗的結果值包含了樣品中DSP含量的總和，而現在市售貝類毒素ELISA法檢測試劑盒利用的原理是抗體-抗原反應，而用于微孔板包被或后期試驗中添加的DSP抗體均為單抗。比如本次試驗中使用的ELISA檢測試劑盒，包被在微孔板上的二抗及試驗中添加的一抗均為單抗，其相對抗原主要為DSP中的OA、DTX-1、DTX-2等，而對其他組分的DSP交叉反應率較小。

本試驗出現小鼠生物法檢測結果比ELISA法較低現象，這雖然和兩種檢測方法原理的對比分析相悖，但在現實試驗中可能較為常見。作為傳統檢測方法，小鼠生物法以檢測步驟操作簡單和可檢測樣品中DSP總量一直被用作檢測DSP含量的首選方法，但實際檢測過程中，因有機溶劑提取階段很難保證DSP被完全提取、減壓蒸餾濃縮階段存在DSP隨有機溶劑揮發的可能，往往會使檢測結果偏低，甚至出現假陰性。小鼠生物法所用樣品量較大，一般為200 g，這使得其在樣品量較小時很難用于檢測。

經過多年發展，ELISA法已經被很好應用到檢測貝類中DSP含量試驗，而且該方法在2016年首次被寫進國家食品檢測標準中，依靠其較低檢出限、較高靈敏度、較快檢測速度逐漸被廣大一線檢測人員所接受，由于需要專門檢測設備和較高檢測試劑盒價格，其推廣度受到影響。具體到實際試驗中，在需要檢測大批量貝類樣品時，可以考慮先用ELISA方法進行初步篩選，如果檢測結果為陰性，可據實出具檢測報告；如果檢測結果為陽性，則可利用小鼠生物法或液相色譜串聯質譜法進行確認。檢測個別樣品時，考慮到成本及操作可行性，可考慮使用小鼠生物法。日常檢測中將兩種方法結合使用，能夠更加準確檢測貝類樣品中DSP含量。