華重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性及其功能預(yù)測(cè)

洪春桃，黃宗興，張玲菊，魏斌，章建紅

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

重樓為百合科重樓屬植物滇重樓(Parispol-yphylla)和華重樓(Parispolyphyllavar.chinensis)的根狀莖，是《中國(guó)藥典》2020年版入藥品種之一，具有清熱解毒、消腫止痛、定肝定驚的功效，也是云南白藥、宮血寧、季德勝蛇藥等中成藥的主要原料藥材，市場(chǎng)需求量逐年攀升[1]。滇重樓與華重樓生長(zhǎng)均緩慢，每年的消耗量遠(yuǎn)大于它的年生長(zhǎng)量，使得其野生資源日益枯竭。由于華重樓具有更廣闊的適生區(qū)域，為了緩解資源危機(jī)，研究人員采用組織培養(yǎng)和內(nèi)生菌發(fā)酵等方法進(jìn)行種苗擴(kuò)繁和藥用成分合成，試圖找到解決華重樓資源緊缺的有效方法[2]。研究發(fā)現(xiàn)，采用華重樓特定部位的根莖可以成功誘導(dǎo)出生長(zhǎng)速率較快的愈傷組織，但是由于華重樓根莖內(nèi)生菌豐富，往往很難獲得其無(wú)菌材料，加大了無(wú)菌培養(yǎng)體系建立的難度[3]。用合適的抗生素處理外植體材料，可以有效控制組織培養(yǎng)過(guò)程中內(nèi)生菌的污染[3]。因此，如能對(duì)華重樓根莖中內(nèi)生菌多樣性和組成進(jìn)行分析，可為在組培過(guò)程中選擇合適的抗生素提供依據(jù)。此外，植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或者相似的活性物質(zhì)，從具有藥用活性的植物中分離出內(nèi)生菌，再?gòu)钠浯x產(chǎn)物中尋找活性化合物，也是解決華重樓資源不足的有效方法之一[4-5]。本研究采用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)，測(cè)定了2年生華重樓根莖的內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其組成，并利用PICRUSt對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，以期為通過(guò)組織培養(yǎng)途徑獲取無(wú)菌材料和分離產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物的菌株提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院橫溪鎮(zhèn)大岙村試驗(yàn)基地的2年生盆栽苗(該苗為采自寧波四明山野生種質(zhì)的籽播苗)。該基地為亞熱帶季風(fēng)氣候，多年平均氣溫16.4 ℃，平均氣溫以7月最高，為28.0 ℃，1月最低，為4.7 ℃；無(wú)霜期一般為230～240 d；多年平均降水量為1 480 mm左右，5至9月占全年降水量的60%；多年平均日照時(shí)數(shù)1 850 h。

隨機(jī)選取15株正常生長(zhǎng)的種苗帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行如下處理：用無(wú)菌鐵鏟將盆栽苗帶根挖出，再用無(wú)菌剪刀將根莖部位剪下，用清水清洗表面土壤，置于75%乙醇中清洗2 min，再用5%次氯酸鈉試劑處理5 min，用無(wú)菌水沖洗3次后，用無(wú)菌手術(shù)刀將根莖切成邊長(zhǎng)為0.5 cm的小方塊，裝入無(wú)菌2 mL離心管中，用液氮處理30 s后保存于-80 ℃冰箱用于DNA提取。為降低誤差，每個(gè)樣本選取3個(gè)根莖混合為1個(gè)樣品，并設(shè)5個(gè)重復(fù)。

1.2 DNA提取和高通量測(cè)序

根莖內(nèi)生菌總DNA采用MP Biomedical Fast DNATMSpin Kit試劑盒(MP Biomedical,Santa Ana,CA,USA)，按照說(shuō)明書步驟提取；然后使用Nanodrop 2000儀器(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA)對(duì)DNA濃度進(jìn)行量化。以檢測(cè)合格的DNA為模板，用338F(5′-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAA T-3′)引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用試劑盒(TaKaRa biotech,Japan)進(jìn)行純化后，再利用Agilent 2100(Agilent，USA)生物測(cè)定儀檢測(cè)片段大小，并用Qubit 2.0熒光光度計(jì)(Life technologies，USA)定量。最后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行等摩爾合并，在Illumina MiSeq平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序(Illumina，USA)。

1.3 下機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)處理

下機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)在QIIME 1.9.1(Quantitative insights into microbial ecology,http://qiime.org/)平臺(tái)進(jìn)行樣品分裝和嵌合體去除[6-7]，利用UCLUST將相似性大于99%的序列歸為同一個(gè)分類操作單元(operational taxonomic unit,OTU)[7]，將OTU中豐度最高的代表序列[8]在Silva128數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，來(lái)確定物種分類信息。使用腳本“filter_taxa_from_otu_table.py”去除葉綠體、線粒體、古菌、不能分類到的細(xì)/古菌界和全部樣品中只出現(xiàn)1次的序列[9]。隨后每個(gè)樣品隨機(jī)選取1 600條序列(樣品中的最低序列數(shù))進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用QIIME計(jì)算α多樣性指數(shù)(豐富度、香農(nóng)指數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性和均勻度)和稀釋曲線[6]。使用PICRUSt方法[10]將高通量測(cè)序所得的16S rRNA擴(kuò)增子數(shù)據(jù)與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得OTU對(duì)應(yīng)物種的功能信息，并根據(jù)最新的Kyoto Encylopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，對(duì)華重樓根莖內(nèi)生菌進(jìn)行功能組成預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序質(zhì)量指標(biāo)與樣品置信結(jié)果

在質(zhì)量控制和將讀數(shù)分配給各自的樣本之前，5個(gè)根莖樣品共獲得355 219條原始序列，質(zhì)控過(guò)濾后共產(chǎn)生336 141條質(zhì)控序列，每個(gè)樣品平均產(chǎn)生67 228條質(zhì)控序列。對(duì)測(cè)得的數(shù)據(jù)依照99%相似性對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類分析，得到OTU分析的代表序列，并對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種注釋，結(jié)果見(jiàn)表1。5個(gè)根莖樣品內(nèi)生菌注釋的門都在14個(gè)以上，平均值為17個(gè)，注釋到綱、目、科、屬和OTU的平均個(gè)數(shù)分別為35、79、134、245和747個(gè)。

表1 華重樓塊莖內(nèi)生細(xì)菌注釋到不同分類水平的數(shù)量

用序列數(shù)與物種數(shù)構(gòu)建樣本的稀釋曲線，用于驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣本中的物種多樣性。如圖1中所示，5個(gè)根莖樣本隨著測(cè)序條數(shù)的增加，曲線都逐漸趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量較為合理，該數(shù)據(jù)量足以反映華重樓根莖樣本中絕大多數(shù)的內(nèi)生菌群信息。OTU排序曲線下降緩慢，表明華重樓塊莖內(nèi)生細(xì)菌分布較為均勻，多樣性較高；豐度最高OTU的相對(duì)豐度為4.6%，相對(duì)豐度在0.5%以上的OTU有25個(gè)，總的相對(duì)豐度為30.5%。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)

對(duì)華重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行群落豐富度指數(shù)分析(Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù))和群落多樣性指數(shù)分析(Phylogenetic diversity指數(shù)和Shannon)，結(jié)果如表2所示。5個(gè)華重樓塊莖重復(fù)樣品豐富度指數(shù)變異較大，而群落多樣性指數(shù)重復(fù)之間變異較小，其Chao1、Observed species、Phylogenetic diversity和Shannon指數(shù)平均值分別為3 417.7、748.0、40.7和8.3。

表2 華重樓塊莖內(nèi)生細(xì)菌α-多樣性指數(shù)

2.3 內(nèi)生細(xì)菌群落組成

華重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌在門水平上主要有變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicute)、放線菌門(Actinobacteria)、醋桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和綠彎菌門(Chloroflexi)等組成，其平均相對(duì)豐度分別為50.4%、24.0%、7.2%、6.3%、5.9%和1.8%。在變形菌門中，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)豐度最高，平均相對(duì)豐度為34.6%；其次為α-變形菌綱，平均相對(duì)豐度為10.4%(圖2)。在屬水平上，共有18個(gè)屬的平均相對(duì)豐度大于1.0%，分屬于5個(gè)門，14個(gè)科，其中平均相對(duì)豐度最高的屬為厚壁菌門丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)的Dubosiella(5.61%)，其次為γ-變形菌綱腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的2個(gè)屬Unclassified bacterium(4.69%)和Pantoea(4.33%)(表3)。

表3 華重樓塊莖內(nèi)生菌優(yōu)勢(shì)屬的種類(相對(duì)豐度大于1.0%)

圖2 五個(gè)華重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌在門水平上的相對(duì)豐度

2.4 16S rRNA功能預(yù)測(cè)

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)華重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌OUT，進(jìn)行基因預(yù)測(cè)。結(jié)果如圖3所示，華重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌功能主要涉及有機(jī)系統(tǒng)、代謝、人類疾病、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和細(xì)胞過(guò)程6個(gè)方面。其中，代謝過(guò)程相關(guān)的基因數(shù)最多，占總基因數(shù)的50.8%，主要包括能量代謝、碳水化合物代謝、氨基酸代謝和輔酶因子和維生素代謝等代謝過(guò)程；其次為遺傳信息過(guò)程，占總基因數(shù)的16.7%，主要涉及復(fù)制和修復(fù)、翻譯等過(guò)程；環(huán)境信息過(guò)程占總基因數(shù)的13.4%，主要涉及膜運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程。

圖3 華重樓根莖內(nèi)生菌功能基因分類

3 小結(jié)與討論

華重樓生長(zhǎng)緩慢、再生周期長(zhǎng)，隨著市場(chǎng)需求量的與日俱增，供需矛盾日趨嚴(yán)重，組織培養(yǎng)是目前人們最為關(guān)注的解決華重樓無(wú)性快繁瓶頸的途徑之一[11]。但利用組織培養(yǎng)來(lái)繁殖華重樓的難度很大，其主要原因是華重樓根莖富含的內(nèi)生菌會(huì)引起外植體的污染，難以獲得華重樓的無(wú)菌材料[3,12]。目前，解決外植體污染最為有效的方法是在外植體轉(zhuǎn)接前用合適的抗生素處理材料，因此，為獲得華重樓的無(wú)菌外植體材料，抗生素的選擇尤為重要。明確華重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成，可以為抗生素的選擇提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，華重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌主要包括17個(gè)門245個(gè)屬，優(yōu)勢(shì)屬為Dubosiella、泛菌屬(Pantoae)、Chujaibacter、產(chǎn)黃桿菌屬(Rhodanobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等，其中泛菌屬、乳桿菌屬和假單胞菌屬等是植物組織培養(yǎng)中常見(jiàn)的引起外植體污染的內(nèi)生細(xì)菌屬[13]。在華重樓根莖中，這3個(gè)屬的平均相對(duì)豐度都大于1.0%，可能是華重樓根莖組織培養(yǎng)中引起污染的主要內(nèi)生菌，在選擇抗生素時(shí)可以針對(duì)這3個(gè)屬選擇合適的抗生素，以達(dá)到獲得無(wú)菌植物材料的目的。

植物內(nèi)生細(xì)菌是一類定殖在植物內(nèi)部的細(xì)菌，其種類組成和結(jié)構(gòu)變化會(huì)受到植物自身生長(zhǎng)狀況和外界環(huán)境的影響，而內(nèi)生細(xì)菌的群落組成也可以影響宿主植物的代謝產(chǎn)物合成，這是導(dǎo)致同一品種中藥材在不同種植地存在品質(zhì)差異的主要原因之一[14]。周先治等[15]從生長(zhǎng)在福建省南平市的健康華重樓根莖中分離的細(xì)菌主要為芽孢桿菌和假單胞菌；魏娟等[16]研究表明，人工栽培的云南重樓根莖中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌以芽孢桿菌和腸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬；宋發(fā)軍等[17]發(fā)現(xiàn)，湖北地區(qū)人工種植的5年生重樓根莖內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌主要為短食單胞菌屬、假單胞菌屬和芽孢桿菌屬。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定了寧波地區(qū)2年生華重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌組成，發(fā)現(xiàn)除了假單胞菌屬，上述文獻(xiàn)中其他菌屬都不是其優(yōu)勢(shì)菌屬。這些結(jié)果說(shuō)明不同地區(qū)種植的重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和組成存在差異。此外，本研究采用的高通量測(cè)序分析結(jié)果更為靈敏，以往研究通過(guò)內(nèi)生菌分離獲得的結(jié)果，可能存在很多不可培養(yǎng)或者難培養(yǎng)菌株未被分離到，進(jìn)而造成了其內(nèi)生菌組成的差異。

內(nèi)生菌與宿主植物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化形成一種互利共存的關(guān)系，一方面植物可以為內(nèi)生菌提供養(yǎng)分和生存場(chǎng)所，另一方面內(nèi)生菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可以幫助植物抵御外界不良環(huán)境、促進(jìn)植物生長(zhǎng)[4,18]。此外，有些內(nèi)生菌還能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或者相似的藥用成分，提高藥用植物的品質(zhì)和產(chǎn)量[4]。內(nèi)生菌的生物學(xué)功能跟其所擁有的功能基因息息相關(guān)，本研究采用PIRCUSt對(duì)華重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，華重樓內(nèi)生細(xì)菌包含大量關(guān)于碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、核苷酸、輔酶及代謝產(chǎn)物合成的基因信息，說(shuō)明華重樓內(nèi)生細(xì)菌可能參與代謝華重樓根莖中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為華重樓植株生長(zhǎng)發(fā)育提供必要的營(yíng)養(yǎng)、激素等作用[9]。此外，還包含萜和多糖類化合物和次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因，說(shuō)明華重樓內(nèi)生菌具有合成藥用活性物質(zhì)的潛力。該研究可為從華重樓根莖分離出生產(chǎn)有效藥用成分的植物內(nèi)生菌提供理論基礎(chǔ)。

本研究通過(guò)Illumina高通量測(cè)序分析明確了華重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性及其組成，初步分析了華重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌種群的功能，為今后選用抗生素處理外植體獲得華重樓的無(wú)菌材料用于華重樓植株的組培快繁、功能微生物菌株分離、挖掘根莖內(nèi)生菌的功能研究和病害生物防控等提供了理論基礎(chǔ)。但是，本研究?jī)H對(duì)華重樓單一種源、單一部位內(nèi)生細(xì)菌群落組成進(jìn)行了分析，缺少不同種源和不同部位內(nèi)生菌比較的分析，同時(shí)缺少對(duì)華重樓根莖內(nèi)生真菌多樣性的分析，有待今后進(jìn)一步研究。