制備色譜技術分離純化天然產物中多酚類化合物的研究進展

夏雅俊，閆維國

(1.蘭州石化職業(yè)技術學院,甘肅 蘭州 730060;2.甘肅省定西市府川鎮(zhèn)中心小學,甘肅 定西 744300 )

作為一種綠色、環(huán)保、可再生資源，植物多酚的應用涉及了眾多領域：(1)醫(yī)藥領域。大量試驗表明，植物多酚具有顯著的抗氧化作用，同時在抗衰老、抑菌、抗微生物、抗病毒、抗腫瘤以及降血脂含量等方面具有顯著功效[1-5]。(2)化工領域。具有"紫外過濾器"之美譽的植物多酚，能夠消耗掉由于人體新陳代謝產生的過剩活性氧自由基，抑制體內酷氨酸酶和過氧化氫酶的活性，從而起到美白活膚、祛斑抗皺、延緩衰老的功效[6]。而多酚的抑菌作用則讓其能夠成為口腔護理劑的理想添加劑。(3)食品領域。植物多酚可以作為食品抗氧化劑以及防腐劑。由于多酚能與蛋白反應，從而可以作為酒或者飲品的澄清劑。同時口服攝入時能，使人產生苦、澀的感覺，將其與甜、酸等味道以一定比例調和后，可以起到調節(jié)食物的口感的作用[7]。(4)環(huán)保領域。植物多酚是優(yōu)良的水穩(wěn)劑，同時還可做為絮凝劑凈化污水[8-9]。因其具有與無機金屬離子絡合的作用，故可將多酚應用與一些土壤重金屬離子污染的治理[10]。(5)農牧業(yè)領域。植物多酚可用于制螯合肥料、抗病蟲害以及抑制土壤酸化[11-13]。

目前，植物多酚主要來源于天然產物，由于多酚類化合物的不穩(wěn)定性導致了其分離制備存在一定的難度。不同類型的制備色譜技術是分離純化多酚類化合物的主要手段，為了更好的將其應用在天然產物中植物多酚的分離制備，本章就近年來采用制備色譜進行純化制備多酚類化合物的方法進行了綜述，以期為后期的多酚分離制備提供一定的參考。

2 柱色譜技術在分離純化天然產物中多酚類化合物的研究進展

自1903年，色譜創(chuàng)始人Svictor首次操作吸附色譜柱以來，已有100多年的歷史。隨著時代的進步，該領域的技術發(fā)展已經趨于成熟，更多的人傾向于應用研究。常規(guī)的柱色譜技術有吸附柱色譜、分配柱色譜、離子柱色譜、凝膠色譜、親和色譜、干柱色譜等，更詳細的分類參閱文獻[14]。用于分離純化的主要為硅膠柱、聚酰胺柱、大孔吸附樹脂柱等吸附色譜柱技術以及凝膠柱色譜技術。

2.1 硅膠吸附柱色譜技術分離純化天然產物中多酚類化合物

與其它純化制備化合物的方法相比，硅膠吸附柱色譜技術有其獨特的優(yōu)點。對揮發(fā)性差、沸點高的物質以及熱穩(wěn)定性差的化合物，硅膠柱色譜在其制備和分離中表現(xiàn)出較強優(yōu)勢。部分多酚類化合物對熱不穩(wěn)定，故其分離純化技術中硅膠柱色譜技術占有一席之地。如王曉飛等[15]采用硅膠吸附色譜柱，將油橄欖葉乙酸乙酯提取物首先以氯仿-甲醇梯度洗脫，得到四個部分，再分別采用分以石油醚-丙酮(8∶2)、氯仿-甲醇(95∶5)、氯仿-甲醇(9∶1)、氯仿-甲醇(85∶15)反復分離重結晶得到15個多酚類化合物，其中1-H-2-苯并吡喃-6,7-二醇、3,4-二羥基苯甲酸、3-羥基-4-甲氧基苯甲酸、異鼠李素、圣草酚、花旗松素是首次從該植物中分離得到。為了研究橄欖油廠廢棄物殘渣中含有降血糖和抗氧化成分，Hamden等[16]利用硅膠柱色譜對其進行純化，獲得了羥基酪醇、咖啡酸、原兒茶酸、木犀草素、對香豆素蘆丁、芹黃素、橄欖苦苷等13個已知的多酚類化合物。這篇文獻首次報道了橄欖油廢棄物特別是其中的羥基酪醇具有抗氧化應激以及降血糖的作用。

2.2 凝膠柱色譜技術分離純化天然產物中多酚類化合物

以分子篩效益著稱的凝膠柱色譜技術，根據其分離對象的水溶性和脂溶性可將其分為凝膠過濾色譜(GFC)和凝膠滲透色譜(GPC)。多酚類化合物具有一定的水溶性，故通常采用GFC對其進行分離純化研究，其代表就是葡萄糖(sephadex)系列的凝膠柱色譜。譚和平等[17]利用Sephadex LH-20凝膠柱色譜從茶葉中分離制備得到了茶多酚，主要成分為EGCG，其回收率和純度均較高。花青素具有不同的聚合態(tài)，其化學結構和生物活性常為研究者關注的熱點，利用凝膠色譜分子篩的作用進行分離純化是較理想的選擇。通常色譜填料在不同的酸堿條件下，會表現(xiàn)出不同的分離效果。Feng[18]等人從該點出發(fā)，處理制得弱酸性陽離子交換凝膠色譜，提高了多酚在凝膠柱上的保留時間，以此實現(xiàn)多酚分離制備。

2.3 聚酰胺吸附柱技術分離純化天然產物中多酚類化合物

聚酰胺樹脂(PA)是由酰胺聚合而成的一類高分子分離材料，它對黃酮類類化合物具有較強的氫鍵作用[19]。阿曼托雙黃酮屬于多酚類化合物，是一種天然抗氧化劑。馮志毅[19]采用聚酰胺吸附柱為富集材料，以總黃酮和阿曼托雙黃酮的含量以及總黃酮的收率為考察指標，評價卷柏總黃酮純化工藝。對聚酰胺粒徑、徑高比、樣品上樣量以及洗脫液濃度進行了考察。除黃酮類的酚類化合物，聚合態(tài)花青素也能通過聚酰胺樹脂柱得到一定程度的分離純化，如李思佳等[20]將甘蔗梢濃縮液上聚酰胺層析柱柱，最終獲得具有不同多酚含量的洗脫成分，并在此基礎上進行多酚保鮮作用的探究。

2.4 大孔樹脂技術分離純化天然產物中多酚類化合物

大孔吸附樹脂(Macroporous adsorption resin，MAR)是近代發(fā)展起來的一類有機高聚物吸附劑，70年代末開始將其應用于中草藥成分的提取分離。 MAR的孔徑與比表面積都比較大，其內部具有三維空間立體孔結構，具有物理化學穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長、宜于構成閉路循環(huán)、節(jié)省費用等諸多優(yōu)點，因此在提取分離中應用較廣泛。Bai等[21]對工業(yè)廢棄蘋果渣中的多酚類抗氧化成分進行探究，采用XAD-16提取分離殘渣中的蘋果多酚，獲得了6個組分(API，APII，APIII，APIV， APV 和APVI)，經高效液相色譜分析得到這些組分中含量最多的是原花青素B2。在此基礎上，采用DPPH和ABTS清除以及FRAP檢測法測定各組分的抗氧化能力特性，證明APIII，即40%乙醇水溶液洗脫獲得的組分，其抗氧化能力最強。馮穎等[22]采用HPD700 型大孔樹脂分離純化無梗五加果中的多酚類化合物。文中通過靜態(tài)吸附解吸附容量進行樹脂篩選，最終發(fā)現(xiàn)HPD700 型的吸附性能最佳；然后對其XAD-6的動態(tài)吸附解吸附參數(shù)進行了探討，得到了具有最佳吸附和解吸附效果的分離純化條件。

2.5 不同的柱色譜技術聯(lián)用分離純化天然產物中多酚類化合物

很多學者將不同類型的柱色譜技術同時采用，取長補短，在天然產物分離分析中應用更為廣泛。吳慧等[23]對綠茶水提取物中主要次級代謝產物進行分離純化，先后依次采用了大孔吸附樹脂、硅膠柱色譜、凝膠柱色譜。最終從綠茶水提取物中分離純化得到了7個多酚化合物。該文獻結合化合物分子結構以及大小，在純化過程中采用不同的制備技術，以達到高效的分離效果，為綠茶水提取物的化學成分的進一步研究提供了技術支持。作為夏季一種清涼爽口的水果，龍眼一直備受人們喜愛，但是由于它屬于非呼吸躍變型果實，存在采后褐變現(xiàn)象，長期保存一直是人們頭痛的問題。Shi等[24]針對這一問題進行了探究，采用聚酰胺柱色譜、凝膠柱色譜以及硅膠柱色譜對龍眼果實果皮組織中多酚氧化酶物質基礎進行分離純化，最終確定(-)-表兒茶素為其作用基質，從而找到了導致龍眼褐變變質的癥結所在，為龍眼的儲存保質提供了一定科學依據。

3 薄層色譜技術在分離純化天然產物中多酚類化合物的研究進展

在分離制備技術的雛形階段，薄層色譜(layer chromatography，LC)憑借其快速、簡便、高分辨率的特點在天然產物分離分析領域占據一席之地，使用最多的便是硅膠吸附色譜，其次便是氧化鋁吸附薄層色譜[14]。制備薄層色譜(Preparative layer chromatography，PLC)的尺寸和厚度均較常規(guī)分析檢測型薄層色譜大，因此其負載量也比分析型薄層色譜高[25-26]。雖然制備薄層色譜比不上凝膠色譜、大孔樹脂、高速逆流色譜等后起之秀，但是它在藥用植物研究中的應用也不能忽略。例如程德軍等[36]經過兩次制備薄層色譜純化技術分離得到杜葉草中的綠原酸。二次制備后，綠原酸的純度能達到91.6%以上，相比其他制備技術，節(jié)省了時間，同時回避了該多酚化合物在堿性條件下的水解。Fu等人[27]將梅肉中采用制備薄層色譜分離純化得到的無色花色苷和兒茶素作為模板分子對臺灣食品"半干腌李子"中紅棕色色素的形成機理進行探討。通過模擬日光以及鎢絲燈照射對半干腌李子的色素形成過程，從中發(fā)現(xiàn)了一些紅棕色色素形成的規(guī)律。

4 液相色譜技術在分離純化天然產物中多酚類化合物的研究進展

在前2節(jié)介紹的制備色譜技術中，常規(guī)柱色譜法雖然能夠獲得大量，高純度的目標化合物，但是它耗時、耗溶劑，長期暴露在空氣中，還可能會導致一些不穩(wěn)定化合物的分解變質；而PLC技術基于無法實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產，已逐步被淘汰。基于這一系列的缺點，逐步發(fā)展建立了壓力制備色譜，包括中低壓制備色譜(柱壓小于2 MPa)以及現(xiàn)在普遍的高壓液相制備色譜技術(壓力大于2 MPa)[14]。高壓制備色譜，又稱高效制備液相色譜(high performance preparative liquid chromatography， HPPLC)，采用HPPLC技術分離和純化天然產物中多酚類化合物的研究報道眾多，基于植物多酚以碳原子骨架的分類特點，本節(jié)對近幾年來，HPPLC技術在植物多酚分離純化中的應用進行了總結。

簡單酚類在天然產物中一般作為代謝中間產物，能夠通過HPPLC技術分離純化得到。如Feng等[28]采用甲醇和水作為流動相，經過制備色譜純化和重結晶操作后，獲得了鄰苯三酚和間苯二酚兩個簡單酚類化合物。經查證，這兩個化合物是首次從該植物獲得。Kanchanapoom和Kasai等[29]經過HPPLC的反復制備純化，獲得了3個毛蕊糖苷類衍生物，其中有1個為該植物中新化合物。該文章中采用水和甲醇為流動相，建立了16個梯度洗脫程序，對利用硅膠柱初步處理的多個組分進行精制。該研究分離純化得到了多個新化合物，對于更深入的了解掌握西南貓尾樹的化學組成具有重要意義。

4.1.2 HPPLC技術分離純化C6-Cn型碳骨架多酚類化合物

利用HPPLC技術分離純化天然產物中C6-Cn型碳骨架多酚類化合物的研究進展見表1 。

表1 HPPLC技術分離純化天然產物中C6-Cn型碳骨架多酚類化合物

4.1.3 HPPLC技術分離純化C6-Cn-C6型碳骨架多酚類化合物

利用HPPLC技術分離純化天然產物中C6-Cn-C6型碳骨架多酚類化合物的研究進展見表2。

表2 HPPLC技術分離純化天然產物中C6-Cn-C6型碳骨架多酚類化合物

5 高速逆流色譜(HSCCC)技術在分離純化天然產物中多酚類化合物的研究進展

5.1 HSCCC技術分離純化天然產物中多酚類化合物

高速逆流色譜技術(High-speed countercurrent chromatography，HSCCC)是由Ito等創(chuàng)建起來的一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術， 它不用任何固態(tài)的支撐物或載體[44]。它相對于傳統(tǒng)的固-液柱色譜技術，具有較強的適用性、操作簡便、高效快速、樣品制備量大、費用低、適用于工業(yè)生產等優(yōu)點。截止2009年，HSCCC已被用于從108中植物中分離純化得到了363中化合物，其中關于分離純化植物多酚類化合物的文獻報道有36篇，所分離得到的多酚類化合物有57個，占總數(shù)的15.7%[45]。可見HSCCC技術在植物多酚的分離純化領域應用廣泛。表3綜述了采用HSCCC技術分離純化天然產物中植物多酚的應用進展。

表3 HSCCC技術分離純化天然產物中多酚類化合物

5.2 HSCCC技術與其它色譜技術聯(lián)用分離純化天然產物中多酚類化合物

除單一的HSCCC分離純化天然產物中植物多酚外，很多文獻報道中，學者將其與其它分離技術聯(lián)用，以達到更高效滿意的效果。如Cao等[51]在分離純化蘋果渣中多酚類化學成分時，比較了凝膠柱色譜和HSCCC技術聯(lián)用與溶劑萃取后直接采用HSCCC分離制備兩種方法對產物純度的影響，發(fā)現(xiàn)將以凝膠柱色譜輔助HSCCC技術能達到更好的分離純化效果。該研究為進一步研究蘋果渣中多酚化合物成分奠定了初步基礎，同時也表明技術整合比單一的技術突破更具有應用價值。為了從洋薊中獲得高純度的多酚類化合物，Shu等[52]將聚酰胺樹脂柱與HSCCC離線聯(lián)用，建立了二者相輔助的分離制備方法。經純化制備后，最終得到綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-蕓香糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和薊多酚，其純度分別為92.0%、98.2%、98.5%、98.0%。

6 展望

隨著科技的不斷進步，制備色譜技術日新月異。從興起之初的紙色譜到目前廣泛使用的HSCCC以及高壓制備色譜，不論是制備的效率、制備的成本還是制備的選擇性上都有巨大提高。

作為液-液分配色譜的典型代表，HSCCC技術在天然產物的分離分析領域具有分離效率高、制備量大、適于工業(yè)生產等優(yōu)點的同時，仍受到一定因素的制約，如溶劑系統(tǒng)的選擇沒有完善的理論指導；而分離選擇性只是憑借經驗操作，機理尚不明確。但是HSCCC技術的研究并未停止，相信未來的HSCCC技術在這些理論體系上會更加完善，以實現(xiàn)實驗室研究到工業(yè)化大生產的過渡。

制備型高效液相色譜(HPPLC)是在分析型高效液相色譜(HPLC)的基礎上發(fā)展的，其理論基礎比HSCCC成熟很多，發(fā)展的更為完善。與HPLC一樣，其核心部件為色譜柱，也成為HPPLC技術進一步完善發(fā)展的制約條件，比如在其色譜填料上，不僅市場價格高，而且其填充技術也存在缺陷，如何獲得優(yōu)質價廉的高性能填料，并發(fā)展均勻密實的填充技術是提高HPPLC技術的分離靈敏度的關鍵所在。HPPLC技術的定性能力差，將制備純化型與分析型的色譜聯(lián)合為整體，實現(xiàn)一體化操作控制的愿景仍有待更深入的研究。