基因拷貝數變異與自然流產的關聯性分析

廣東醫科大學順德婦女兒童醫院（佛山市順德區婦幼保健院）（528300）麥富巨 劉鳳芝 趙卓姝

自然流產是現在多見的妊娠并發癥，常無征兆發生，也來不及挽救，發病率約15%～20%，且每年都有上升的趨勢[1]。其發病原因與遺傳學因素、環境因素、免疫疾病、孕婦內分泌疾病等密切相關[2]。研究表明，胎兒染色體異常是引起早期流產的主要原因之一[3]。目前，絨毛等流產組織的核型分析是檢測染色體異常的重要方法。但絨毛細胞采樣及培養的要求較高，且培養的成功率往往較低，并且只能分辨大于5Mb左右的條帶，分辨能力有限，難以得到理想的結果[4][5]。近年來，隨著新一代測序技術(NGS)的快速發展，第二代測序技術在拷貝數變異(CNVs)檢測中越來越具有可行性。本研究利用CNV-seq檢測流產組織，探討基因拷貝數變異與自然流產的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧分析2019年1月～12月在我院確診的自然流產的流產物186例。早期流產138例，中晚期流產48例；患者年齡20～44歲，平均（31.74±5.29）歲，其中高齡孕婦58例；孕周5～36周，平均為（10.98±4.89）周。檢測均獲患者及家屬知情同意并簽署知情同意書，并通過醫院醫學倫理委員會審核。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 患者均在知情同意的情況下，行人工流產術，采集流產組織約5～10g，用無菌生理鹽水反復沖洗后，放入15mL離心試管內冷凍保存，其中絨毛組織181份，臍帶組織2份，皮膚組織3份；抽取病患3mL抗凝血（EDTA抗凝）用于進行母源污染檢測，將所有樣本送至湖南家輝遺傳專科醫院進行檢測。

1.2.2 DNA提取與測序 提取流產組織10mg，用生理鹽水反復沖洗后進行DNA提取并檢測所得DNA的濃度、純度以及DNA片段的完整性。將檢驗合格的DNA基因組，隨機打斷成小片段核酸，采用北京貝瑞和康的高通量測序文庫試劑盒，通過末端修復，接頭連接等方式構建文庫；構建的文庫采用KAPASYBR FAST qPCR試劑盒進行實時熒光定量，檢測合格后，使用Illumina平臺的Nextseq CN 500高通量測序儀進行大規模測序[6]。將所得的測序Reads與人類參考基因組(grch37/h919)進行匹配。為了確定CNVs的意義，筆者將篩選待測樣本DNA重復或缺失區域的檢測數據，并與DGV、Decipher、OMIM、UCSCs、PubMed等數據庫進行比對。此外，使用STR分析方法檢測母體血液DNA和流產組織DNA，獲得母源污染的概率。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS19.0軟件分析觀察項數據，采用百分率（%）表示計數數據，計數資料通過χ2檢驗表示。P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 在不同孕期的染色體異常檢測結果＜12周的流產胚胎染色體異常約為47.10%（65/138），≥12周的流產及死胎染色體異常約為29.17%（14/48），差異具有統計學意義。見附表1。

2.2 在不同年齡段的染色體異常檢測結果 年齡在35歲以下病患的流產組織染色體異常率為39.06%（50/128），大于等于35歲高年齡患者流產組織染色體異常約為53.45%（31/58），但兩組間染色體異常率差異無顯著的統計學意義（P＞0.05）。見附表2。

2.3 染色體非整倍體檢驗情況流產組織染色體異常中共有非整倍體異常83例，其中單體16例，14例為45,X，2例分別為45,X[20%]/46,XN[80%]嵌合體和45,XN,-3[40%]/46,XN[60%]嵌合體；共有52例三體型，涉及除1，3，4，6，7，10，11，12，19外的染色體，而占比在前三位分別是22三體、16三體及18三體。患者中有2例為雙三體，染色體多倍體涉及病患11例。同時，83例病患中涉及到嵌合體非整倍體6例，異常嵌合占比為20%～80%。具體見附表3。

2.4 染色體基因組微缺失/微重復變異檢測情況 使用CNVs分析對186例樣本開展檢測的結果如下，62例樣本中檢出CNVs：微缺失8例，微重復42例，有12例病例為微缺失合并微重復；CNVs合并非整倍體異常共有11例。62例具有CNVs樣本中37例為1處CNVs，9例為2處CNVs，4例為3處CNVs，1例為4處CNVs；62例CNVs具體分類情況見附表4。

附表1 不同孕周染色體異常檢查結果（例）

附表2 不同年齡段染色體異常檢查結果（例）

附表3 流產物染色體非整倍體、多倍體及正倍體異常情況

附表4 62例微缺失/微重復結果分類

3 討論

據統計，流產原因中遺傳方面占比高達50%～60%，染色體異常則為遺傳導致流產的最多見的原因。近年來，染色體異常的檢測方法更加多樣化，如MLPA、FISH，流產組織的檢測也采用SNParray、arrayCGH方式，擴大了染色體異常可檢測的范圍。目前，低深度的CNV-seq被廣泛應用，隨著未來測序深度的增加，CNV-seq將取代微陣列技術，成為一種更可擴展、更經濟的常規染色體疾病檢測技術。186例成功標本中，染色體數目異常者83例；微缺失和微重復綜合征5例，多態性4例，致病性不明者53例。流產胚胎的主要原因仍然是染色體非整倍體改變，大多為染色體三體及45,X的單體，而除45,X外的其他染色體單體較為少見；大部分染色體都會發生染色體增加，染色體增加發生率最高的是22號染色體，其他染色體概率相當，而并不是集中發生于21號、13號、18號染色體。對此，臨床中一度對流產組織進行FISH分析，但是因為能用的僅有染色體13、18、21、X、Y的探針，所用的探針有限，所以用此種方法分析流產組織的檢出率非常有限，效果不理想。本研究共檢出6例嵌合體，分別是45,X[20%]/46,XN[80%]，45,XN,-3[40%]/46,XN[60%]，47,XN,+20[40%]/46,XN[60%]，48,XN，+16,+18[70%]/47,XN,+18[30%]，68,XNN,-11[70%]/69,XNN[30%]，47,XN,+16[80%]/46,X,+16[20%]，證明了高通量測序技術檢測嵌合體的高敏感性，能對20%的嵌合體做到有效檢出，有國內外研究CNV-seq甚至可發現5%的嵌合體。

由于高通量測序技術的高靈敏度和高分辨率，在能夠準確地檢測染色體非整倍體的同時，也能夠檢測到不小于100Kb的微缺失和微重復。本研究結果顯示，186例流產樣本中發現致病性未知的CNVs 53例，致病性CNVs5例和多態性的CNVs4例。檢測結果中致病力未知的CNVs的占比最大，在臨床實際使用中，利用高通量測序技術檢出的數量眾多的致病力未知的遺傳信息仍存在爭議。高通量測序結果的遺傳咨詢和解釋是目前臨床遺傳咨詢面臨的難題，對臨床工作者來說是一個巨大的挑戰。

染色體異常與流產時間具有相關性，根據統計分析186例流產時間和染色體異常相關，發現染色體異常的懷孕前12周流產的占47.10%，而大于12周的流產及死胎染色體異常占29.17%，兩組數據差異存在統計學意義(P＜0.05)，表明染色體異常是早期胚胎損失最重要的原因之一。有專家的相關研究顯示，35歲以上孕婦的染色體異常發生率高達68.38%，較35歲以下孕婦的56.24%顯著較高。本研究結果顯示大于35歲的染色體異常率為（53.45%），而小于35歲組的染色體異常率為（39.06%），但兩組數據無顯著的統計學差異（P＞0.05），提示大于35歲孕婦的染色體異常發生率雖有所升高，但因為樣本量等原因，所以有必要予以進一步研究。

通過本研究，筆者發現高通量測序技術可以在覆蓋全基因組時檢測基因組拷貝數的變化。除了檢測染色體非整倍體的變化外，還可以檢測常規核型分析無法發現的致病性微失衡，發現致病性和可能致病性的CNVs，可以顯著提高異常的檢出率。