松材線蟲檢測形態(tài)辨識法實踐

謝麗玉

(三明市梅列區(qū)自然資源局森防站，福建 三明 365000)

1 引言

松材線蟲病傳入我國已有幾十年了，由于松樹感染初期潛伏期長，癥狀隱蔽卻致病性極強，一旦表象顯現(xiàn)已很難治愈，最短40多天內(nèi)即可枯死，因而導(dǎo)致大面積松樹林區(qū)遭遇毀滅性災(zāi)害。該松樹枯萎病,也被公認為松樹的“癌癥”[1]。梅列區(qū)自2004年初發(fā)生松材線蟲病疫情以來，加大除治力度，通過采取有效措施，有效遏制了的疫情蔓延、擴散勢頭。 2019年松材線蟲病秋季普查，初步發(fā)現(xiàn)松枯死木476株，其中:不明原因67株,涉及松林小班面積461.2 hm2，分布在陳大鎮(zhèn)臺溪村、砂蕉村、臺江國有林場，尤其在葉坑高速公路兩側(cè)及電力、通訊走廊周邊松林較多。針對各個小班疑似感

染松材線蟲松樹實際表象，通過觀察，對疑似病感松樹采樣，在伐倒木主干上、中、下部截取3 cm厚圓盤,帶回實驗檢測。

2 材料與方法

2.1 材料

(1)調(diào)查和取樣陳大鎮(zhèn)臺溪村、砂蕉村、臺江國有林場不明原因松枯死木主干上、中、下部圓盤，取樣工具有油鋸和標本袋。

(2)樣品松材線蟲檢測所需工具：劈刀、剪刀;線蟲分離裝置 ( 鐵架,漏斗,乳膠管, 止水夾,餐巾紙,試管,滴管,酒精燈,載玻片,蓋玻片等); XS-18C生物顯微鏡、電腦。

2.2 貝爾曼漏斗法

由貝爾曼提出的貝爾曼漏斗法是線蟲學(xué)研究基本方法之一。因為裝置簡單操作方便，被廣泛應(yīng)用于松材線蟲調(diào)查鑒定和檢疫檢驗中[2]。分離松材線蟲運用貝爾曼漏斗法時，通常需要將處理過的樣品浸泡 24 h后，待過濾沉淀才能鏡檢是否有線蟲。常規(guī)分離鏡檢法具體操作步驟：首先將直徑12～18 cm的玻璃漏斗下端接一段長約10～15 cm的乳膠管，分別置于漏斗架上，并用止水彈簧夾夾住乳膠管下端確保不漏水；將標本逐一劈成小片，呈火柴桿大小狀后剪碎，再把待分離樣品用大小合適的紗布包好放入漏斗中，盛滿清水完全浸泡,在線蟲的趨水性和重力作用下，線蟲逐步下沉至乳膠管底部。靜置24 h后，用清潔的玻璃試管套住漏斗下方乳膠管尾端，輕捏止水彈簧夾接取線蟲分離液約 5～10mL，放置試管架靜置片刻，肉眼可見底液混濁。用吸管輕入試管底部取微量分離液，滴1、2小水珠于載玻片上，用蓋玻片勻開分離液并蓋上，擱至顯微鏡載物臺上，打開攝影端，先用最小倍物鏡搜索，鎖定疑似目標，再轉(zhuǎn)換更高倍的物鏡放大觀察，也可點擊捕獲截圖鑒別。如有需要可用酒精燈或打火機將載玻片上的線蟲熱殺固定，以便于鑒別。

2.3 病原線蟲形態(tài)學(xué)鑒定法

2.3.1 觀察唇區(qū)、口針、中食道球形狀情況

松材線蟲的主要形態(tài)學(xué)特征: 成蟲頭部均具有明顯的溢縮、口針和中食道球,其中唇區(qū)高溢縮明顯，口針細且基部稍微膨大，中食道球呈卵形占其體寬的 2 /3 以上[3]。由于線蟲幼期形態(tài)特征不穩(wěn)定，很難鑒別雄雌，因此在鑒定過程中，幼蟲不作為鑒定和判別的依據(jù)，一般要找到成蟲才可進行進一步鑒別。

2.3.2 觀察成蟲的雌雄形態(tài)

松材線蟲雄成蟲的尾部呈圓錐形，交合刺大，呈弓狀，喙突明顯，遠端膨大似盤狀，向腹部彎曲如鷹爪，末端有一卵形交合傘包裹。這里應(yīng)注意區(qū)分：擬松材線蟲雄成蟲交合傘端部平截為板狀，而松材線蟲雄成蟲交合傘為卵圓形。在顯微鏡下雄成蟲交合刺的形態(tài)比較明顯，易于鑒別。但只有在找到雌成蟲的特征后，才能做出判斷。

松材線蟲的雌成蟲尾部形態(tài)為指形，蟲體后部約73%處有陰門開口，并有較寬的陰門蓋。熟記其尾部特征，再觀察陰門蓋，就能夠迅速辨識松材線蟲的雌成蟲。如果發(fā)現(xiàn)部分雌成蟲有短的尾尖突(通常小于2 μm)，鑒別時必須考慮與擬松材線蟲的特征相對比進一步觀察，擬松材線蟲的尾部與雄松材線蟲的尾部一樣也呈圓錐狀，但其尾端的尾尖突長度一般為 3.5～5 μm，比松材線蟲的長[4]。 觀察過程中，要注意把擬松材線蟲和松材線蟲區(qū)別開來。

表1 2019年秋季普查松材線蟲病樣品檢測記錄

3 結(jié)果與分析

通過對陳大鎮(zhèn)臺溪村、砂蕉村、臺江國有林場樣本進行的貝爾曼漏斗法實驗形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)(表1),采樣中近半有雄雌松材線蟲,樣樹主干中部為感染多發(fā)區(qū)域，可能與松墨天牛取食產(chǎn)卵的選點有關(guān)。

4 小結(jié)與討論

4.1 鏡下觀察體會

(1)通過多次鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)雖然可采用電腦捕獲截屏圖辨識活體，但有些蟲體活動過于活躍，需用打火機在載玻片下來回移動火苗烤3 s左右，使蟲體固定便于觀察。熱殺固定后一般雌蟲呈展開“C”形，雄蟲成“J”形[5](圖1～4)。

圖1 砂蕉15-13-4固定后的雄蟲

圖2 臺溪47-3-1 雌蟲尾部

圖3 臺溪49-6-3 雌蟲

圖4 臺江34-15-1雄蟲特征

注意鏡下觀察時,先使用顯微鏡最小倍鏡目瀏覽查看,一旦發(fā)現(xiàn)疑似蟲體,再根據(jù)需要轉(zhuǎn)換高倍鏡目觀察辨識。

(2)由于每批樣本較多，浸泡24 h后的樣液需盡快檢測出結(jié)果，長時間俯身引頸，緊挨顯微鏡目鏡搜尋身體容易疲勞。如果改善配置，使用帶有攝影端的顯微鏡放置電腦顯示屏旁，并連接電腦同步顯像，只需端坐在電腦顯示屏前觀看屏幕，單手操作載物臺移動手輪和聚光鏡升降手輪調(diào)節(jié)即可。這對于需要長時間觀察或者近視、老花眼觀察不便的檢測人員來說，不失為一種便捷方法。

4.2 討論

(1)經(jīng)過采樣檢測，陳大鎮(zhèn)臺溪村、砂蕉村、臺江國有林場部分小班松樹確定感染松材線蟲病。由于該病種早期潛伏期長且隱蔽，針對松材線蟲病的檢測，除了活立木主干電鉆取樣外，還需進一步探究在染病初期能夠有又快又方便、減少樹體傷害的檢測方法。盡管松材線蟲的形態(tài)鑒定方法由于雌成蟲的尾形、尾尖突、雄蟲的交合傘端部形態(tài)在種間有部分重疊現(xiàn)象而可能造成錯檢缺陷，在松材線蟲疫情反復(fù)、基層森防站人員少防治任務(wù)重、實驗室條件簡陋的情況下，目前基層多采用該方法，仍然有較普遍的實用性。只要熟練握采樣、分離、鑒定幾個重點環(huán)節(jié)的工作，基本上辨識準確率可達95%以上，為迅速準確辨識、加快后續(xù)環(huán)節(jié)的處置贏得時間。

(2)在常規(guī)的防疫除治基礎(chǔ)上，倡導(dǎo)“預(yù)防性早診治”理念，不能僅限于春秋季普查后統(tǒng)一除治，護林員巡山一旦發(fā)現(xiàn)有松樹異常就要抓緊取樣檢測，簡化程序及時診斷治療。依據(jù)孟俊國的研究,松墨天牛的蛀入孔、蛹室和羽化孔分布在樹枝上的數(shù)量要遠高于樹干上的[6]。這表明松墨天牛幼蟲多集中在樹枝危害，如果采樣時間點提前，應(yīng)注重樹枝取樣，在病感早期檢測診斷，及時去除病枝，將病蟲扼殺在萌芽狀態(tài)。