基于微流控的RT-LAMP基因芯片工業設計方法研究

鄭鎮欽

摘要：新型冠狀病毒SARS-CoV-2導致的新冠肺炎（COVID-19）正在全球肆虐，核酸檢測是新冠病毒檢測的“金標準”，快速檢測SARS-CoV-2感染是評估病毒傳播情況至為重要的要求。本文首先介紹逆轉錄環介導等溫擴增反應和結果判定方法，進一步從工業設計的角度，提出基于逆轉錄環介導等溫擴增技術RT-LAMP和微流控技術的核酸檢測設計要求，提供多種新型即時檢驗（POCT）的設計方案，最后展望了發展的前景。

關鍵詞：微流控;LAMP;核酸檢測

一、逆轉錄環介導等溫擴增反應（RT-LAMP）

環介導等溫擴增技術英文名稱為“Loop-mediated isothermal amplification”，簡稱LAMP。自2000年日本學者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開以來，廣泛應用于檢測食源性病原菌、沙門氏菌、金色葡萄球菌、單增李斯特菌、HIV、HPV、流感等以DNA為遺傳物質的病原微生物和病毒的檢測，并以靈敏度高、成本低、反應時間短、臨床使用不需要特殊的儀器、操作簡單等技術優勢，被認為是最具有發展前景的核酸檢測技術。

基于逆轉錄環介導等溫擴增（RT-LAMP）檢測病毒RNA的方法有潛力成為簡單、可擴展和廣泛適用的檢測方法。對于SARS-CoV-2、流感病毒這類以RNA為遺傳物質的病毒來說，需要先進行反轉錄之后再實施LAMP反應，也就是RT-LAMP。方法是在反應體系中加入反轉錄酶，反應即可進行，仍可保持很高的效率性和特異性。與現有普遍使用的基于逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）的方法相比，RT-LAMP檢測是一種對設備要求更低、檢測靈敏度高且快速的檢測方案。

同時，LAMP具有快速、高效等優點。因為不需要預先的雙鏈DNA的熱變性，避免了溫度循環而造成的時間損失。核酸擴增在1h內均可完成，添加環狀引物后時間還可以節省1/2左右，在20-30min內就可檢測到擴增產物，1h內可擴增出109個靶序列拷貝，且產物可以達到0.5mg/ml。對某些病毒的擴增，模板可達幾個拷貝數即可，比PCR高出幾個數量級，因此還具有高靈敏度。進一步的，因為是針對靶序列的6個區域設計的4種特異性引物，6個區域中任何一處與引物不匹配均不能進行核酸擴增，因此具有高特異性。

二、LAMP核酸檢測的結果判定

LAMP核酸檢測的結果判定，除了傳統的核酸電泳檢測外，還可以通過以下方法：

一是通過濁度來判定。LAMP反應階段，隨著反應的進行，dNTP會釋放出焦磷酸根離子，焦磷酸根離子遇到Mg2+會生成焦磷酸鎂白色沉淀，一般情況下，生成的白色沉淀與反應液中雙鏈DNA的量是成正比的，因此可以通過濁度儀檢測白色沉淀的量來定性反應的進行程度。

二是顯色反應判定。擴增結束后，其最后的產物是一系列反向重復的靶序列構成的莖環結構和多環花椰菜結構的DNA片段混合物，因此可以使用鈣黃綠素或羥基萘酚藍（HNB）來顯色，通過肉眼和即時攝像AI識別來判斷反應結果。

三是通過PH值來判定。LAMP反應過程中產生大量焦磷酸，pH變化明顯，因此還可通過在體系中加入酚紅等pH值敏感的染料來進行判斷，這個方法的檢測靈敏度非常高，但穩定性較差。

三、微流控RT-LAMP基因芯片的設計

微流控基因芯片是基于微流控技術的PCR反應裝置，可以由PDMS或者玻璃材質制成。在檢測新冠病毒SARS-CoV-2的設計中，RT-LAMP反應室可以集成多個微腔體以及相互連接的微通道，用于病毒基因的分析，具有很好的特異性，適用于病毒基因突變。而且微流控RT-LAMP基因芯片具有質硬、高度透明及化學穩定性好，可耐酸堿性，體積小巧，樣本需求小，成本低，有利于攝像實時檢測等特點。

微流控RT-LAMP基因芯片導熱性能良好，能夠保持恒定反應溫度，從而顯著提高擴增速度，同時，具有高度集成性，全封閉性，能夠減少手工操作，有效避免樣本污染。

四、工業設計的技術路徑

環介導等溫擴增技術（LAMP）與微流控檢測技術結合的核酸擴增檢測系統非常適合于應用于POCT（即時檢測），技術完美結合是最具發展前景的應用方向之一。它簡化了核酸擴增檢測中繁瑣的樣品前處理和擴增產物檢測步驟，檢測結果可視。在工業設計中，既可以以機器視覺AI來判讀，也可以人工視覺判讀。

微流控RT-LAMP基因芯片的設計即恒溫擴增，擴增過程無需溫度變化的LAMP型，具體又分為以下方式：

一是碟式LAMP微流控基因芯片設計方案。碟式芯片沿著圓周設計8通道倍數通量的樣品檢測孔，每個檢測孔即一個PCR管，注液體積為幾微升至幾十微升，檢測時間小于30min。碟式芯片一般可以分為三層，上下兩層為硬度高、透明度好的玻璃材質;中間一層采用PDMS材質，并在中間層設計微流控通道和微流控腔室;三層之間用壓敏膠（PSA）粘合。

二是卡式LAMP微流控基因芯片設計方案。卡式芯片可以集成泵、閥門、微通道、反應和試劑儲液池，是卡片式立體工藝設計。卡式芯片為并聯式分布，一般通量較小，為4至8通量。卡式LAMP微流控基因芯片采用聚苯乙烯均聚物注塑而成，可以用于雜交膜檢測和核酸檢測，20-30min內完成RT-LAMP檢測，分析靈敏度可達每毫升100病毒顆粒。此外，卡式LAMP微流控基因芯片有利于集成AI智能判讀功能和攝像分析功能。

三是PDMS-紙基混合微流控LAMP基因芯片設計方案。該方案不用對PDMS進行表面處理，而是將先進的“紙基”芯片工藝引入到LAMP裝置中。該設計方案同樣分為三層，底層由玻璃載片，用于支撐作用。中間為紙基芯片，設計有微流控通道和微流控腔室，頂層為是PDMS材質，設計有加樣入口。

五、LAMP微流控檢測技術展望

LAMP和微流控同為最具發展前景的技術方向，雖然應用場景和技術要求各不相同，但是隨著微流控制作工藝的提升，并且在微閥、微泵、微反應器等功能元器件的組合下，功能將越來越豐富，應用領域逐漸寬廣。基于逆轉錄環介導等溫擴增技術RT-LAMP和微流控技術的即時檢驗（POCT）儀器，具有特異性強、靈敏度高、樣品消耗少、節省時間、檢測高效和操作簡便等技術優勢，相信隨著技術的不斷發展，在不久的將來，應該可以成為應對新冠病毒等突發、新發傳染性疾病的有力工具，為守護人類生命健康起到重要的作用。

基金項目：廣東省基礎與應用基礎研究基金項目