對蝦養殖池副溶血弧菌的分離鑒定及其耐藥特征、毒力基因分析*

李翠蘋 翟倩倩 王 想,4 李 健,3①

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；

2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農村農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島 266071；3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071；4. 中國海洋大學 海水養殖教育部重點實驗室 青島 266003)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛存在于養殖水域、底泥和沉積物中，附著于海洋生物的體表進行生長繁殖，為重要的病原性弧菌，其引發的水產動物疾病不僅會對水產養殖業造成重大的經濟損失，還對人體健康構成潛在威脅(黃夢詩等, 2019; 王娜等, 2016; 李國等, 2008; Su et al, 2007)。目前，副溶血弧菌已成為世界上多個沿海國家和地區急性胃腸炎的重要病原菌之一，嚴重者可引起傷口感染和敗血癥等。在我國，副溶血弧菌引起的食物中毒高居微生物性食物中毒的第2位(Hu et al, 2016; Chen et al, 2016)。與副溶血弧菌致病力相關的毒力因子主要為溶血素類，包括耐熱直接溶血素(Thermostable direct hemolysin, TDH)、不耐熱直接溶血素(Thermolabile hemolysin, TLH)和耐熱相關溶血素(TDH-related hemolysin, TRH)(Wang et al, 2008)。其中，分別由tdh和trh基因編碼的TDH和TRH被認為是副溶血弧菌的主要致病因子，幾乎存在于所有臨床分離株中，而來自美國、歐洲和亞洲的研究分析顯示，環境樣品中的tdh和trh基因的陽性率僅為0～6% (Alam et al, 2002; Hervio-Heath et al, 2002; Depaola et al,2000)。

使用抗生素是治療和預防細菌性感染的重要手段，在水產養殖過程中抗生素的過度使用和不規范使用，導致副溶血弧菌耐藥性逐年上升，甚至出現交叉耐藥和多重耐藥等現象，給水產疾病的治療帶來巨大挑戰(張德福等, 2018; Li et al, 2014)。耐藥細菌一旦通過食物鏈等途徑傳播給人類，將會導致臨床抗生素治療的失效，嚴重威脅人類健康。

本研究旨在調查山東地區對蝦養殖池中副溶血弧菌的耐藥狀況，并從分子層面對其毒力基因的攜帶情況進行調查，以期為我國臨床治療副溶血弧菌感染及水產養殖業合理使用抗生素提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株 2018年4～8月期間，分別從山東省日照、青島、煙臺和濰坊4個地區養殖場內，隨機采集12個對蝦健康生長無病害的養殖池內的水樣，每個池塘隨機取4個不同地點的水樣，每個地點15 ml，混合均勻后，取100 μl涂板。經分離純化，共得到50株副溶血弧菌，具體采樣信息及菌株數見表1。藥敏性測定標準質控菌株大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC25922，購自北納生物。

表1 50 株副溶血弧菌采樣點信息Tab.1 Sampling site information of 50 strains of V. parahaemolyticus

1.1.2 實驗藥物及試劑 慶大霉素、鹽酸多西環素、氟苯尼考、氯霉素、硫酸新霉素、磺胺甲噁唑、復方新諾明、恩諾沙星、諾氟沙星、頭孢他啶、氨芐西林和呋喃唑酮12 種抗生素藥敏紙片均購自杭州微生物試劑公司。TSB 液體培養基、TCBS 培養基和MH 瓊脂培養基，均購自青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 實驗儀器 超凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)、PCR 擴增儀(美國Bio-Rad 公司)、麥氏比濁儀(法國Bio-Meriux 公司)、電泳儀(美國Bio Rad公司)和凝膠成像系統(美國Kodak 公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離純化 在超凈工作臺內，將水樣均勻涂布于TCBS 瓊脂培養基，置于28℃恒溫培養箱內培養20～24 h，觀察菌落形態。將培養出的細菌進行劃線純化，再挑取單菌落接種到TSB 培養基，過夜培養，部分菌液置于4℃冰箱保存備用，部分菌液加20%甘油凍存于–80℃冰箱。

1.2.2 菌株鑒定 挑取TCBS 平板上的疑似副溶血弧菌藍綠色單菌落，利用副溶血弧菌生化檢測試劑盒進行生化鑒定，生化實驗陽性的菌株，利用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，具體方法按照說明書進行。針對副溶血弧菌16S rRNA 和HSP60設計2 對特異性引物進行PCR 擴增，PCR 反應體系為：DNA 模板2 μl；上下游引物F/R (10 μmol/L)各1 μl；2×Reaction Mix 10 μl；滅菌ddH2O 5.9 μl；Golden DNA 聚合酶0.1 μl。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析后，選取條帶明亮的樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上進行同源比對。本研究所用全部引物序列及反應條件見表2。

1.2.3 副溶血弧菌藥敏實驗 采用美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的Kirby-Bauer 紙片法對副溶血弧菌進行12 種常見抗生素的藥物敏感性實驗，副溶血弧菌過夜培養后，用0.85%無菌生理鹽水調菌液濃度至0.5 麥士比濁度，用無菌棉簽涂布整個MH 培養基后貼藥敏紙片，28℃恒溫培養箱內培養24～28 h，測量抑菌圈直徑。以大腸桿菌菌ATCC25922 作為質控菌株。記錄各類藥物對副溶血弧菌菌株產生的抑菌圈直徑，并根據CLSI 標準對實驗結果進行判定(表3)。

表2 引物序列及反應條件Tab.2 Primer sequence and reaction condition

表3 抗菌藥物抑菌圈直徑判定標準(mm)Tab.3 Criteria for judging the diameter of antimicrobial circle (mm)

1.2.4 副溶血弧菌毒力基因檢測 用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取副溶血弧菌基因組DNA，采用PCR 對毒力基因tdh、trh 進行檢測。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及反應條件見表2。PCR 反應體系為同1.2.2。PCR 產物于1.5%瓊脂糖(1.0×TAE)凝膠電泳20 min 后，使用凝膠成像系統分析結果。將條帶明亮的樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

2 結果

2.1 副溶血弧菌的分離鑒定

從山東省日照、青島、煙臺和濰坊4 個地區采集的對蝦養殖池中的水樣，經TCBS 分離純化培養后，對其進行16S rRNA 和HSP60 基因擴增，將單一明亮的目的條帶送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI-Blast 比對后，確定50 株副溶血弧菌(GenBank 登錄號分別為 MN419060、MN419061、MN419062、MN419063、MN419064、MN419065、MN419066、MN419067、MN419068、MN419069、MN419070、MN419071、MN419072、MN419073、MN419074、MN419075、MN419076、MN419077、MN419078、MN419079、MN419080、MN419081、MN419082、MN419083、MN419084、MN419085、MN419086、MN419087、MN419088、MN419089、MN419090、MN419091、MN419092、MN419093、MN419094、MN419095、MN419096、MN419097、MN419098、MN419099、MN419100、MN419101、MN419102、MN419103、MN419104、MN419105、MN419106、MN419107、MN419108 和MN419109)，47 株分離自山東青島卓越海洋集團有限公司對蝦養殖池，3 株分離自山東海陽黃海水產養殖有限公司對蝦養殖池。

2.2 副溶血弧菌的藥物敏感性分析

50 株副溶血弧菌的藥物敏感性結果見表4。僅1 株副溶血弧菌對所有抗生素均表現為敏感，其余49 株呈現出不同程度的抗生素抗性，98%的菌株具有耐藥性。耐藥率最高的是氨基糖苷類藥物慶大霉素和硫酸新霉素，分別達98%和90%；其次是青霉素類藥物氨芐西林，耐藥率為86%；此外，水產養殖中禁止使用的硝基呋喃類藥物呋喃唑酮，耐藥率高達74%。所分離副溶血弧菌對酰氨醇類藥物氟苯尼考、氯霉素較敏感，耐藥率均為10%。副溶弧菌分離株多重耐藥情況嚴重，多重耐藥菌44 株，占總菌株數的88%，最嚴重的可耐7 種抗菌藥物，其中，耐6 種抗生素的菌株數量最多(32%)，多重耐藥菌株的比例見圖1。

表4 50 株副溶血弧菌的藥敏實驗結果Tab.4 Drug susceptibility test results of 50 strains of V. parahaemolyticus

圖1 副溶血弧菌多重耐藥菌株比例Fig.1 Proportion of multidrug resistance of V. parahaemolyticus

2.3 毒力基因檢測

耐熱直接溶血素和耐熱相關溶血素是副溶血弧菌的主要毒力因子，通過PCR對毒力基因進行檢測，并將條帶明亮的樣品測序，結果顯示，50株副溶血弧菌均未檢測到tdh基因，僅2株副溶血弧菌檢測到trh基因，trh攜帶率為4%。trh毒力基因PCR擴增結果見圖2。

圖2 部分副溶血弧菌trh 基因擴增電泳圖譜Fig.2 Electrophoretogram of the trh gene amplification from some of the V. parahaemolyticus

3 討論

現階段，細菌耐藥性問題已經引起世界范圍的廣泛關注，世界衛生組織(WHO)將其作為21 世紀威脅人類健康的重大挑戰之一(Levy et al, 2004; Neu,1992)。2016 年9 月5 日，G20 峰會上通過的《二十國集團領導人杭州峰會公報》中明確指出，抗生素耐藥性嚴重威脅公共健康、經濟增長和全球經濟穩定，并認為有必要從體現20 國集團自身優勢的角度，采取包容的方式應對抗生素耐藥性問題，以實證方法預防和減少抗生素耐藥性，同時推動研發新的和現有的抗生素。《2017 年食品安全關鍵技術研發重點專項申報指南》中，將重要食源性致病菌耐藥機制及傳播規律研究作為首要研究任務，要求針對我國食源性致病菌耐藥性不斷加重的嚴峻形勢，重點關注水產品和畜禽產品等具有世界性優勢的農產品，以食源性致病菌為對象，研究細菌耐藥性產生與傳播的機制。耐藥性副溶血弧菌不僅給海水養殖業帶來巨大的經濟損失，還可通過食物鏈傳播給人類，嚴重威脅人類食品安全和身體健康，并給臨床治療帶來巨大挑戰(Li et al,2015; Willis, 2000)。作為最重要的食源性致病菌之一的副溶血弧菌的耐藥性及致病性應引起足夠重視。

美國最早于1978年發現了氨芐西林抗性的副溶血性弧菌菌株(Blake et al, 1979)，到目前為止，抗藥性副溶血性弧菌在全球都有檢出，并隨著抗藥能力的提高，研究者從臨床和水產品中分離得到越來越多的副溶血性弧菌多重耐藥菌株。2009年上海市售水產品分離的副溶血弧菌，有近70%的菌株對氨芐西林表現為耐藥，并有20株表現為多重耐藥，對萘啶酸等3種抗生素完全敏感(安秀華等, 2009)。廣東省2014年分離病例源、食品源副溶血弧菌共60株，其對氨芐西林均耐藥，磺胺復合物耐藥率達43.3%，對慶大霉素等其他抗生素的耐藥率均低于10.0%(李柏生等, 2015)。在大西洋海岸美國馬里蘭州沿海海灣分離的副溶血弧菌，對青霉素類抗生素的耐藥率很高，其中，青霉素耐藥率為68.00%，氨芐西林耐藥率為53.00%，對哌拉西林和鏈霉素的耐藥率較低，均為4.00%(Shaw et al,2014)。根據魏大偉(2018)報道，臨床及水產品中副溶血弧菌抗生素耐藥率較高，環境中除了青霉素類耐藥以外，總體表現為對抗生素敏感。這與本研究結果有所不同，本研究從山東省4個地區水產養殖環境分離得到50株副溶血弧菌，這50株副溶血弧菌對抗生素的耐藥現象已相當普遍，除對青霉素類的氨芐西林產生較高的耐藥率外，對氨基糖苷類的慶大霉素和硫酸新霉素的耐藥率也極高，分別達98%和90%。對氟苯尼考、氯霉素和頭孢他啶具有較高的敏感性。絕大部分菌株出現多重耐藥現象。此外，47株耐藥菌株均分離自山東青島卓越海洋集團有限公司對蝦養殖池，調查資料顯示，該養殖場早年常用的抗生素包括慶大霉素和硫酸新霉素，可能是本研究結果中慶大霉素和硫酸新霉素耐藥率高的重要原因。但值得注意的是，無論是臨床分離株、水產品分離株，還是環境分離株，均對氨芐西林有較強的耐藥性，揭示副溶血弧菌耐藥問題已越來越嚴重，不僅臨床分離株耐藥現象嚴重，環境分離株耐藥現象也越來越嚴重，同樣需要加強防范。副溶血弧菌耐藥性的產生與傳播應引起足夠的重視。為實現水產養殖健康發展，有必要繼續開展菌株耐藥監測，及時發現各類致病性弧菌菌株的耐藥變化趨勢，并在水產養殖過程中合理使用抗生素。

副溶血弧菌有一系列的毒力相關因子，包括黏附素、生物膜、鐵載體、胞外蛋白酶、耐熱直接溶血素、耐熱直接相關溶血素、Ⅲ型分泌系統和Ⅵ型分泌系統(Raghunath, 2015)。其中，TDH 和TRH 是副溶血弧菌的主要毒力因子，與副溶血弧菌引起的腸胃炎密切相關。研究表明，約90%的臨床分離株攜帶溶血素基因，而環境分離株極少攜帶tdh 和trh (Banerjee et al,2014; Mahoney et al, 2010)。本研究與其研究結果相吻合，山東地區50 株環境分離副溶血弧菌均不攜帶tdh 基因，4%的菌株表現為trh 陽性，本研究50 株副溶血環境分離株均分離自對蝦健康生長無病害的養殖池塘，可能是毒力因子陽性率低的重要原因。雖然，環境分離株和水產品分離株tdh 和trh 的攜帶率低，多為非致病性和弱致病性，但最近研究表明，越來越多的臨床株被發現不攜帶此類基因。例如，Jones 等(2012)報道，發現約27%的臨床菌株為tdh 和trh 基因陰性。WHO 的《2011 年關于海產品中副溶血弧菌風險評估報告》顯示，不攜帶tdh 或trh 基因的臨床分離株比率在增加，這些菌株可能攜帶其他導致腸毒性毒力因子，并且可產生重癥病例(李柏生等, 2015;鄭文龍等, 2015)。因此，仍需加強對這一食源性疾病重要致病因子的了解，從而更好地預防和控制副溶血弧菌的感染和流行，減輕副溶血弧菌導致的經濟損失和疾病負擔。

為研究副溶血弧菌耐藥性與毒力因子的相關性，婁陽(2016)從上海水產品中分離出的副溶血性弧菌菌株中發現，氨芐青霉素和頭孢唑林的抗性分別為85%和30%，而攜帶tdh 基因的分離菌，其耐藥率明顯高于別的菌株。但Baker-Austin 等(2008)在不同的季節，采集了美國喬治亞州和南卡羅來納州附近大西洋海岸3 個位置的海水和沉積物，共分離350 株副溶血弧菌，對其毒力基因進行分析，卻發現毒力株的耐藥性略低。本研究分離得到攜帶trh 的副溶血弧菌2 株，均為多重耐藥菌株，耐藥種類分別為耐慶大霉素、硫酸新霉素、磺胺甲惡唑、恩諾沙星、氨芐西林、呋喃唑酮和耐慶大霉素、硫酸新霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、頭孢他啶、氨芐西林和呋喃唑酮，但其他不攜帶毒力基因的菌株也多為耐藥菌株，且耐藥譜包含以上幾種抗生素。因此，不能得出副溶血弧菌耐藥性與毒力因子相關的結論，仍需要進一步研究探討。