不同光照周期對日本囊對蝦生長、蛻皮和糖代謝的影響*

王 想 任憲云 繩秀珍 李翠蘋 李 健①

(1. 中國海洋大學 海水養殖教育部重點實驗室 青島 266003；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島 266071；3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071；4. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306)

日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicas)原稱日本 對蝦，其肉質鮮嫩，具有耐低溫、耐干燥、生長速度快、價格遠高于其他經濟蝦類等優點，現已成為許多沿海地區的重要養殖品種(王克行, 1997)。目前，日本囊對蝦主要以池塘養殖為主，養殖密度偏低，同時，又受底質選擇(徐涵等, 2015)、病害頻發(韓琳等,2018)、同類相殘(陳學雷等, 2003)等因素的影響，養殖難度加大。日本囊對蝦近2～3 年總體產量不斷增加(袁曉初等, 2016; 徐樂俊等, 2018)，但仍然滿足不了當前市場的需求，供需矛盾上升，急需探尋一種新的養殖模式來解決此問題。對蝦工廠化養殖始于20 世紀末，在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)養殖中應用較為成熟，但因日本囊對蝦有底質選擇、同類相殘、晝伏夜出的生物學特性，難以直接借鑒凡納濱對蝦工廠化養殖的經驗(李玉全等, 2013)。

光作為重要環境因子，直接或間接影響水生動物的生長、攝食、存活和繁殖等(周顯青等, 2000)。周期性的光強變化和光色波動都會影響凡納濱對蝦的生長(Guo et al, 2012、2013)，不同的光照周期也會影響刺龍蝦(Sagmariasus verreauxi)的幼體變態發育(Fitzgibbon et al, 2012)；在室內條件下，LED 燈作為光源可以提高凡納濱對蝦的成活率和產量(Fleckenstein et al, 2019)；王馨等(2014)研究不同光照強度對三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)呼吸代謝的影響，表明三疣梭子蟹工廠化養殖的適宜光照強度為1500 lx；劉偉等(2011)研究表明，不同光色對中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)稚蝦耗氧率晝夜變化節律影響顯著，藍色光下，中國明對蝦代謝耗能較高、存活率較低；同時，光也會通過光照強度和光照周期的變化影響甲殼動物的蛻皮抑制激素(MIH)的分泌，進而影響其蛻皮過程(李旭光等, 2014)。在大多數有眼柄的甲殼動物中存在X-器竇腺復合體，該器官合成和分泌高血糖激素家族，包括高血糖激素(CHH)、MIH、性腺抑制激素(GIH)和大鄂器抑制激素(MOIH)。它們協同調控甲殼動物的生長、繁殖、蛻殼等生理生化過程，其中，蛻皮主要受眼柄中MIH和Y器中蛻皮激素(EH)的調控(楊濟芬等, 2009; 亓一舟等, 2010)。當甲殼動物受到外界壓力時，多種神經遞質[5-羥色胺(5-HT)]等會促進X-器竇腺復合體中的高血糖激素家族分泌，MIH 阻礙EH 的分泌，高血糖激素也參與蛻皮的調控，在這個過程中起抑制作用，同時，高血糖激素調節血糖水平(de Kleijn et al, 1995;Fanjul-Moles, 2006)，調控肝胰腺中的糖原代謝，維持各個組織與器官的能量供應；而在糖原代謝過程中，存在關鍵性的酶來調控此反應的進行，糖原磷酸化酶(GP)是糖原分解中重要的限速酶，糖原合酶(GS)控制著糖原生成的速度(Nagai et al, 2011)。日本囊對蝦有晝伏夜出的生活習性，所以，對光照周期也有一定的要求，此前關于光照對日本囊對蝦生長的研究已有報道，但僅停留在存活率、生長等表觀指標 方面(周志華等, 1999)，罕見其有關生理影響機制方面的報道。本研究以日本囊對蝦為對象，在室內條件下，探究不同光照時間對日本囊對蝦生長、蛻皮和糖代謝的影響，以期為日本囊對蝦工廠化養殖提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗于2018 年7 月7 日～9 月5 日在山東濰坊海豐水產養殖有限責任公司進行，歷時60 d。日本囊對蝦苗購于山東日照海辰水產有限公司，經過約15 d的暫養后用于實驗。暫養期間，水體溶解氧(DO)>5 mg/L，日換水量為總水量的20%～30%，每日投喂4次(07:00、12:00、17:00、22:00)冰鮮大鹵蟲(Artemia salina)。白天和晚上投喂比例為4∶6；投喂量占蝦總體重的15%～20%。實驗用沙購于市場，經篩網篩選后，得到粒徑不超過0.5 mm 的細沙，并經ClO2溶液消毒處理，清水沖洗，晾干后備用。實驗對象初始體長為(1.930±0.217) cm，初始體重為(0.064±0.020) g。

1.2 實驗設計

本實驗設置全黑暗(D)，光照:黑暗=10L:14D，光照:黑暗=14L:10D，全光照(L) 4 個不同的實驗組，所有實驗組均設置3 個平行，所用光源為白熾燈，光照強度為200 lx。在體積為200 L 的白色PVC 桶中進行實驗，內鋪設厚度為10 cm 的細沙，注水140 L，每桶放30 尾日本囊對蝦，在桶的最上層固定網目為10 目的紗網，以防止日本囊對蝦跳出。

1.3 實驗管理

實驗期間，日投餌量約為日本囊對蝦體重的10%～15%，分別于08:00、17:00 進行投喂，上午：傍晚投喂比例為3∶7；每日07:00 用虹吸管換底層水20%～30%，所用海水為自然海水，水溫為26.1℃～31.5℃，鹽度為30.69～33.46，pH 為7.94～8.22。實驗期間，保持連續充氣，使水體DO 含量≥5mg/L，發現死蝦及時撈出。

1.4 樣品收集和指標測定

實驗前隨機取30 尾日本囊對蝦測量體重。實驗期間，每隔30 d 從各實驗組隨機選取6 尾日本囊對蝦(蛻殼間期)，分別取血清、肝胰腺，所有操作均在冰上進行。測血清中5-HT、CHH、MIH、EH 的濃度；測肝胰腺中GS、GP 的酶活，上述指標均由上海酶聯生物科技有限公司提供的試劑盒測定，所有操作按說明書上的步驟進行。血清是經血液與抗凝劑(檸檬酸酸三鈉7.49 g/L、NaCl 19.6 g/L、葡萄糖22.8 g/L、乙二胺四乙酸二鈉3.3 g/L、pH 為7.5)體積1∶1 混合后，4℃，3500 r/min 離心10 min 獲得。每日統計不同光照周期組的日本囊對蝦蛻殼數；實驗結束后，統計各組存活個數，并測量其體重。

1.5 數據計算與統計分析

實驗結束后，日本囊對蝦的成活率(Survival rate,SR,%)、體重特定生長率(Specific growth rate, SGR,%/d)和蛻殼率(Molting frequency rate, MF, %/d)分別按下列公式計算：

式中，N1和N2為實驗開始時日本囊對蝦個數和結束時死亡對蝦的個數，W2和W1為結束和初始時對蝦的濕重(g)；T 為實驗持續的時間(d)；Nm為實驗期間蛻殼次數；Ns為每桶養蝦數。

采用SPSS 25.0 軟件進行數據分析，利用單因素方差(One-way ANOVA)和多重比較檢驗分析不同光照組日本囊對蝦生長、神經遞質5-HT、各激素濃度和糖代謝酶活性的差異，P<0.05 為顯著水平。采用Origin 2018 軟件繪制圖表。

2 結果

2.1 光照周期對日本囊對蝦存活、生長、蛻皮的影響

不同光照周期對日本囊對蝦存活、生長、蛻皮的影響見表1。從表1 可以看出，經過不同的光照時間，日本囊對蝦的存活情況受到不同程度的影響。實驗進行到49 d 時，L 組日本囊對蝦已全部死亡；實驗結束時，D 組SR 最高，為(60.000±2.722)%，14L:10D 組和10L:14D 組SR 差異不顯著(P>0.05)，但隨著光照時間的增加，SR 顯著下降(P<0.05)。

光照周期顯著影響日本囊對蝦的生長(表1)。L 組實驗結束時，日本囊對蝦全部死亡，其SGR 沒有數據。D 組的SGR 最高，為(6.966±0.686)%/d，顯著高于14L:10D 和10L:14D 組，10L:14D 和14L:10D 組相比差異不顯著(P>0.05)。

不同光照周期對日本囊對蝦MF 有顯著影響。D組的MF 顯著高于14L:10D 和10L:14D 組，為(4.667±0.363)%/d (P<0.05)，10L:14D 和14L:10D 組相比差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同光照周期對日本囊對蝦存活、生長、蛻皮的影響Tab.1 Effects of different photoperiod on survival,growth and molting of M. japonicas

2.2 光照周期對日本囊對蝦5-HT、CHH、MIN 和EH 濃度的影響

實驗結束時，L 組日本囊對蝦已全部死亡，無法取樣，相關指標無法檢測，因此，60 d 時只能進行前3 個實驗組的比較。

不同光照周期對日本囊對蝦5-HT 濃度的影響見圖1。從圖1 可以看出，30 d 時，隨著光照時間的延長，對蝦血清中的5-HT 濃度不斷提高，D 組的5-HT濃度顯著低于其他3 個實驗組(P<0.05)，為(0.086±0.030) ng/ml；10L:14D 和14L:10D 組的5-HT 濃度顯著低于L 組(P<0.05)，但10L:14D 和14L:10D 組間相比差異不顯著(P＞0.05)。隨著實驗的進行，各個實驗組的5-HT 濃度均有不同程度的增加；60 d 時，D 組的5-HT 濃度顯著低于10L:14D 和14L:10D 組，為(0.444±0.005) ng/ml (P<0.05)；但10L:14D 和14L:10D組間相比差異不顯著(P>0.05)。

不同光照周期對CHH 濃度的影響見圖2。從圖2可以看出，隨著實驗的進行，不同處理組的 CHH濃度不斷提高。30 d 時，隨著光照時間的延長，各實驗組的CHH 濃度不斷升高，D 組的CHH 濃度顯著低于10L:14D、14L:10D 和L 組(P<0.05)，為(0.007±0.001) ng/ml；10L:14D 和14L:10D 組顯著低于L 組(P<0.05)，但10L:14D 和14L:10D 組相比差異不顯著(P>0.05)。60 d 時，D 組的CHH 濃度顯著低于10L:14D和14L:10D 組(P<0.05)，為(0.041±0.002) ng/ml，10L:14D和14L:10D 組相比無顯著差異。

圖2 不同光照周期對日本囊對蝦CHH 濃度的影響Fig.2 Effects of different photoperiod on the concentrations of CHH in M. japonicas

不同光照周期對MIH 濃度的影響見圖3。從圖3可以看出，實驗進行30、60 d 時，隨著光照周期的增強，日本囊對蝦血清中的MIH 濃度不斷升高。30 d時，D 組的MIH 濃度顯著低于其余3 個實驗組(P<0.05)，為(0.055±0.002) ng/ml，10L:14D 和14L:10D 組間無顯著差異(P＞0.05)，但這2 個實驗組顯著低于L 組(P<0.05)。60 d 時，D 組顯著低于10L:14D 組和14L:10D組，為(0.066±0.002) ng/ml；10L:14D 和14L:10D 組間差異不顯著(P>0.05)。

不同光照周期對EH 濃度的影響見圖4。從圖4可以看出，30、60 d 時，隨著光照時間的延長，日本囊對蝦血清中的EH 濃度不斷降低。其中，30 d 時，D 組的EH 濃度顯著高于其余3 個實驗組(P<0.05)，為(0.070±0.012) ng/ml，剩余3 個實驗組間無顯著差異，但L 組的EH 濃度是4 個實驗組中最低的。60 d時，D 組的EH 濃度顯著高于10L:14D 和14L:10D 組(P<0.05)，為(0.146±0.015) ng/ml；10L:14D 和14L:10D組相比無顯著差異(P>0.05)。

2.3 光照周期日本囊對蝦GP 和GS 活性的影響

圖3 不同光照周期對日本囊對蝦MIH 濃度的影響Fig.3 Effects of different photoperiod on the concentrations of MIH in M. japonicas

圖4 不同光照周期對日本囊對蝦EH 濃度的影響Fig.4 Effects of different photoperiod on the concentrations of EH in M. japonicas

圖5 不同光照周期對日本囊對蝦GP 活性的影響Fig.5 Effects of different photoperiod on the activity of GP in M. japonicas

不同光照周期對GP 活性的影響見圖5。從圖5可以看出，實驗進行30、60 d 時，隨著光照時間的延長，對蝦肝胰腺中的GP 活性不斷升高。30 d 時，D組GP 活性顯著低于其余3 個實驗組(P<0.05)，為(0.088±0.009) U/ml，10L:14D 和14L:10D 組相比無顯著差異，但這2 個組顯著低于L 組(P<0.05)。60 d時，D 組顯著低于10L:14D 和14L:10D 組，為(1.173±0.400) U/ml；10L:14D 和14L:10D 組相比差異不顯著(P>0.05)。

不同光照周期對GS 活性的影響見圖6。從圖6可以看出，30、60 d 時，隨著光照時間的延長，日本囊對蝦肝胰腺中的GS 活性不斷降低。其中，30 d 時，D 組的GP 顯著高于其余3 個組(P<0.05)，為(43.155±2.844) U/ml，10L:14D 和14L:10D 組相比無顯著差異，但這2 個實驗組顯著高于L 組(P<0.05)。60 d 時，D 組的GP 顯著高于10L:14D 和14L:10D 組，為(41.997±2.942) U/ml；10L:14D 組和14L:10D 組相比差異不顯著(P>0.05)。

圖6 不同光照周期對日本囊對蝦GS 活性的影響Fig.6 Effects of different photoperiod on the activity of GS in M. japonicas

3 討論

3.1 不同光照周期對甲殼動物存活和生長的影響

許多研究表明，光照周期對甲殼動物的存活和生長有影響，但因種而異(王芳等, 2004; Baloi et al,2013; Pati et al, 2015; 俞震頡等, 2016)。王芳等(2005)研究表明，14L:10D 和18L:6D 光周期不影響中國對蝦的生長；周志華等(1999)研究表明，全黑暗狀態下，日本囊對蝦的存活率和生長率最高；Pati 等(2015)研究表明，黑暗狀態下，斑節對蝦(Penaeus monodon)的生長速度最快；Andrés 等(2010)研究認為，遠海梭子蟹(Portunus pelagicus)最適宜生長的光周期為18L:6D。本研究結果顯示，全黑暗狀態下，日本囊對蝦的SR、SGR、MF 最高，10L:14D 和14L:10D組相比差異不顯著；與周志華等(1999)、Pati 等(2015)的研究結果基本一致，與Andrés 等(2010)的研究結果有所不同。可見，不同物種間最適宜生長的光照周期是有所差異的。

3.2 不同光照周期對甲殼動物蛻皮的影響

甲殼動物的生長與蛻皮主要受不同神經激素的調控(Chen et al, 2003)，而生物胺主要調節這些激素的合成和釋放(Richardson et al, 1991)。5-HT 作為生物胺的一種，是存在甲殼動物神經系統中的一種重要神經遞質，間接調節各種生理過程，包括新陳代謝、繁殖和甲殼動物的蛻皮等(Fingerman et al, 1994)。當受到外界環境脅迫時，甲殼動物會釋放神經遞質(5-HT等)促進MIH 的釋放，從而對蛻皮進行調控，同時，甲殼動物蛻皮也受Y 器官分泌EH 的調節，這2 種激素有拮抗的作用(de Kleijn et al, 1995; Fanjul-Moles,2006)。Aiken(1969)研究表明，長時間光照會抑制甲殼動物的MIH 合成與釋放，從而縮短蛻皮周期時間，短時間光照則效果相反。而徐建榮等(2006)則認為，光照對甲殼動物蛻皮的影響因其不同發育階段的變化而變化，長時間光照會影響中華絨毛蟹(Eriocheir sinensis)Ⅰ～Ⅳ期幼蟹的蛻殼生長，而當大眼幼體變態發育到Ⅰ期仔蟹后，對光照的適應性也由趨光性轉為避光性，主動選擇水草以及掩蔽物等弱光區域進行蛻皮。本研究表明，隨著光照時間的延長，日本囊對蝦體內的5-HT 濃度不斷升高，MIH 濃度也隨光照時間的增加而不斷升高，EH 濃度有下降的趨勢，最終不同組的MF 也呈顯著下降的趨勢。D 組的5-HT、MIH濃度顯著低于有光照組(P<0.05)，EH 濃度顯著高于有光照組，但有光照組間差異不顯著；D 組的MF 顯著高于10L:14D 和14L:10D 組(P<0.05)，10L:14D 和14L:10D 組之間差異不顯著。這表明在黑暗狀態下，日本囊對蝦受到的脅迫程度最小，最適宜生存，而全光照下，日本囊對蝦受到的脅迫程度最大，最不適宜其生存。本研究中，EH 濃度的變化趨勢與MF 有所不同，推測光照時間達到一定時長后，可能不會對蛻皮激素的分泌產生促進作用，但同時對其產生作用的光照時長范圍還未確定，有待進一步研究。

3.3 不同光照周期對甲殼動物糖代謝的影響

當受到外界環境脅迫時，甲殼動物會釋放神經遞質(5-HT 等)促進CHH 的釋放，CHH 作用于肝胰腺，參與糖原代謝，從而調節血糖水平(楊濟芬等, 2009;Nagai et al, 2011; Fossat et al, 2014)。在糖原代謝過程中，存在2 種調節糖原的合成和分解至關重要的酶，分別為GS 和GP。本研究中，隨著光照時間的延長，5-HT 濃度不斷提高，CHH 激素也不斷增加，GP 活性不斷上升，而GS 活性不斷降低。第30 天時，D組的5-HT、CHH 濃度和GP 活性顯著低于光照組(P<0.05)，10L:14D 和14L:10D 組間差異不顯著，但是低于L 組(P<0.05)；D 組GS 活性顯著高于光照組(P<0.05)，10L:14D 和14L:10D 組間差異不顯著，但顯著高于L 組(P<0.05)。第60 天時，日本囊對蝦5-HT、CHH、GP、GS 含量呈現與第30 天相同的趨勢。這表明在全黑暗狀態下，糖原分解代謝水平最低，有利于糖原積累，進而促進對蝦的生長。有研究表明，在凡納濱對蝦體內注射多巴胺(DA)、5-HT 后，血淋巴酚氧化酶活力明顯升高，溶菌和抗菌活力顯著下降，而且DA 比5-HT對免疫指標的影響更顯著(胡發文等,2007)。生物胺作為一種神經內分泌信號，引發甲殼動物產生不同的免疫應激適應過程，導致機體免疫防御能力下降。本研究結果表明，5-HT 濃度隨光照時間的延長而增加，從側面也說明，光照時間越長，日本囊對蝦機體免疫能力越低，其SR 也越低。綜上所述，日本囊對蝦最適宜生長的環境為黑暗狀態。