十足目虹彩病毒(DIV1)環介導等溫擴增(LAMP)檢測方法的建立及應用*

鄒 瑩 郭曉萌 萬曉媛 邱 亮 張慶利①

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海水養殖病害防治重點實驗室青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室青島市海水養殖流行病學與生物安保重點實驗室 青島 266071；2. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306)

蝦血細胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus, SHIV)和紅螯螯蝦虹彩病毒(Cherax quadricarinatus iridovirus, CQIV)是近年報道的、虹彩病毒科中可感染甲殼類的2種新發病毒(Xu et al, 2016; Qiu et al,2017)，對對蝦養殖業構成了威脅。2014年，SHIV首次在浙江一養殖場的凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)中被發現。隨后幾年的流行病學調查顯示，我國沿海包括河北、山東、江蘇、浙江和福建等省部分區域養殖凡納濱對蝦中均有SHIV檢出(Qiu et al,2017、2018)。Xu等(2016)研究顯示，紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)中分離到的一種虹彩病毒(CQIV)對凡納濱對蝦也具有較強致病性。

SHIV基因組為雙鏈DNA，長度約為166 kb，與CQIV的基因組同源性為99.97%。2019年，國際病毒分類委員會將二者作為2個病毒株，統一命名為十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus, DIV1)，并將其歸入虹彩病毒科的一個新屬——十足目虹彩病毒屬(Decapodiridovirus)(Xu et al, 2016; Qiu et al, 2017、2019; 陳形, 2019)。目前，虹彩病毒科共有6個屬，其中， 蛙 病 毒 屬(Ranavirus) 、 腫 大 細 胞 病 毒 屬(Megalocytivirus)和淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)均可感染魚類等脊椎動物(Chinchar et al, 2011; Kurita et al, 2012)。例如，大鯢虹彩病毒(Giant seaperch iridovirus, GSIV)感染會導致大鯢(Andrias davidanus)全身水腫、多臟器受損，該病毒的流行使大鯢養殖業遭受了重大打擊(孟彥, 2013)；而新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)則會引起石斑魚全身性疾病，威脅石斑魚養殖業的發展(Teng et al, 2008; Li et al, 2014)。研究發現，DIV1可感染凡納濱對蝦、紅螯螯蝦、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)、克氏原螯蝦(Procambarus clarki)和脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)的造血組織和血細胞，被感染細胞出現核固縮，細胞質內可見嗜堿性包涵體(Qiu et al, 2017、2019)。感染DIV1后的對蝦出現肝胰腺顏色變淺、空腸空胃、停止攝食、活力下降等癥狀(Qiu et al, 2017、2019)。

目前，DIV1的檢測主要依賴Qiu等(2018)基于ATPase 基 因(GenBank 登 錄 號：KY681040)建 立 的TaqMan探針實時熒光定量PCR和套式PCR檢測方法(陳蒙蒙, 2017; 邱亮, 2018)。由于DIV1實時熒光定量PCR方法對檢測儀器設備要求較高，檢測時間長，無法實現在取樣現場對患病對蝦進行快速檢測。而環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)具有擴增效率高、擴增速度快、恒溫擴增無需復雜儀器設備等特點，非常適用于現場檢測(Priyanka et al, 2019; Jiang et al, 2012; Shirato, 2019)，目前已被廣泛應用于人類、動物衛生和食品相關病原微生物的檢測(Notomi et al, 2015; Wong et al, 2018; Silva et al,2020)。因此，本研究基于DIV1的主要衣殼蛋白基因建立了其LAMP檢測技術，以期為DIV1病原的實驗室和現場檢測及防控提供新的技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

參考Qiu 等(2017)的方法，對購自山東日照的健康凡納濱對蝦進行DIV1 人工感染實驗，并使用基因組DNA 提取試劑盒(天根, 北京, 中國)提取健康個體和患病個體的基因組DNA。利用NanoDrop 2000c 測定所提取 DNA 的質量和濃度(Thermo Scientific,Waltham, 美國)，然后，將DNA 保存于–80℃冰箱備用。研究中用到的蝦肝腸胞蟲(EHP)、致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(VpAHPND)、對蝦偷死野田村病毒(CMNV)、傳染性皮下及造血組織壞死病病毒(IHHNV)、白斑綜合征病毒(WSSV)、桃拉綜合征病毒(TSV)和黃頭病毒(YHV)等病原陽性核酸均來源于作者實驗室。

1.2 DIV1-LAMP 引物設計

本研究利用Primer Explorer V5.0 軟件，根據DIV1 的衣殼蛋白基因序列(GenBank 登錄號為ATE87157.1)，設計了3 對LAMP 擴增引物(表1)，包括2 條內引物、2 條外引物以及2 條環引物。由上海生工生物技術有限公司合成該引物。

表1 DIV1-LAMP 反應引物序列Tab.1 Primer sequences for DIV1-LAMP assay

1.3 DIV1-LAMP 反應條件優化

以DIV1 陽性核酸為模板，25 μl LAMP 初始反應體系中包含2.5 μl 10×Isothermal amplification buffer、4 mmol/L MgSO4、1.2 mol/L Betaine、1.2 mmol/L dNTPs、1.6 μmol/L DIV1-FIP/BIP、0.2 μmol/L DIV1-F3/B3、0.8 μmol/L LF/LB、6.4 U Bst 2.0 WarmStart?DNA 聚合酶、0.8 μmol/L EvaGreen?及適量的水，于實時熒光定量PCR 儀(Bio-Rad, California, 美國)中設置8 個溫度梯度(58.0℃～68.0℃)，反應50 min (50 個循環，每個循環1 min)；MgSO4終濃度按照3.2、4.0、4.8、5.6 mmol/L，dNTPs 終濃度按照0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L 進行反應體系正交實驗優化；Bst 2.0 WarmStart?DNA 聚合酶用量按照3.2、4.8、6.4、8.0、9.6 U 進行添加；核酸染料EvaGreen?終濃度分別按照0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μmol/L 的添加量進行優化。每個待優化指標的單個變量設置3 個重復，依據擴增Ct值和SD 值選出最佳反應條件。

1.4 DIV1 的質粒標準品制備

以DIV1陽性核酸為模板，通過DIV1-F3/B3引物進行PCR擴增，獲取DIV1靶基因核酸目的片段。將純化的目的片段接入pMD18-T載體(TaKaRa, 大連, 中國)進行克隆和測序驗證，對測序驗證正確的克隆擴大培養。隨后，用質粒提取試劑盒(Omega Inc.,Norcross,美國)提取pMD18-DIV1質粒，利用NanoDrop 2000c測定質粒濃度。用TE緩沖液將pMD18-DIV1質粒10倍梯度稀釋成質粒標準品，置于–80℃保存備用。

1.5 DIV1-LAMP分析靈敏度檢驗和標準曲線的建立

使用梯度稀釋的pMD18T-DIV1 質粒(3.54×109～100拷貝/反應)和無RNA 酶H2O 作為模板，獲得DIV1的LAMP 擴增曲線以確定該方法的檢測靈敏度，使用BioRad CFX96 軟件(版本6.0.14)，以擴增的Ct值(y)相對于pMD18-DIV1 質粒濃度的對數值(x)生成標準曲線。每個濃度設置3 個重復。

1.6 DIV1-LAMP 分析特異性檢驗

分別以EHP、VpAHPND、CMNV、IHHNV、WSSV、TSV 和YHV 等病原的陽性DNA 或cDNA 為模板，檢驗本研究所建立的LAMP 方法的特異性。反應以3.54×105拷貝/反應pMD18-DIV1 質粒為陽性對照，以未感染DIV1 的對蝦組織DNA 為陰性對照，以無RNA 酶的水為空白對照。

1.7 DIV1-LAMP 方法可重復性和可重現性檢驗

按照世界動物衛生組織(OIE)《水生動物疫病診斷手冊》中檢測方法確認章節的要求，對新建立的DIV1-LAMP 檢測方法進行可重復性和可重現性分析。LAMP 檢測方法組內可重復性測試，采用10 倍濃度梯度稀釋的質粒為模板，對每個濃度的模板設置3 次平行測試，利用平行測試產生的Ct平均值和標準偏差(SD)來計算組內變異系數CV。可重現性則以不同實驗室環境條件下LAMP 檢測方法對質粒標準品擴增曲線的穩定性來評定，并利用SPSS 軟件單因素方差分析(One-way ANOVA)對擴增Ct值進行差異顯著性分析。

1.8 DIV1-LAMP 方法對實際樣品的檢驗

利用本研究建立的LAMP 方法對人工感染DIV1的凡納濱對蝦樣品進行定性分析，同時，利用TaqMan熒光定量PCR 對上述樣品進行定性和定量分析，并對比DIV1-LAMP 檢測方法和TaqMan 熒光定量PCR的分析結果。

1.9 基于FTA 卡和LAMP 的DIV1 現場快速檢測方法

利用1.2 μl GeneFinder?替換DIV1-LAMP 反應體系中的EvaGreen?，并將其通過粘附劑預先封閉于200 μl PCR 小管管蓋內，PCR 管內添加30 μl DIV1 LAMP 反應預混液(不含模板和熒光染料EvaGreen?)；按照Whatman FTA 卡說明書，利用其提取4 尾人工感染DIV1 的凡納濱對蝦組織核酸及2 尾健康對蝦組織核酸，將核酸分別加入上述含有30 μl DIV1 LAMP反應預混液的PCR 小管內，同時，設置陽性對照和陰性對照；在64.4℃條件下，保溫50 min，然后，通過在 90℃條件下保溫 3 min 使預置在管蓋內的GeneFinder?染料脫落進入LAMP 反應預混液，完成擴增產物染色。PCR 小管內有擴增產物生成，則顯示為熒光綠色，表明樣品為DIV1 陽性；PCR 小管內無擴增產物生成，則顯示為橙黃色，表明樣品為DIV1陰性。

2 結果

2.1 DIV1 的LAMP 反應體系條件的優化

LAMP優化結果顯示，擴增反應溫度在64.4℃時，Ct值(15.44)和重復間Ct值標準偏差(SD值)(0.09)最小(圖1a)。在64.4℃擴增溫度下，綜合考慮擴增Ct均值及重復測試Ct值標準偏差最小、成本經濟和方法穩定等因素，確立優化后的擴增反應預混體系中dNTPs和MgSO4的濃度分別為1.2和4.0 mmol/L (圖1b)，Bst 2.0 WarmStart?DNA 聚 合 酶 的 用 量 為6.4 U(圖1c)，EvaGreen?的用量為0.8 μmol/L (圖1d)。

2.2 DIV1-LAMP 分析靈敏度檢驗與標準曲線的建立

使用優化后的LAMP 反應體系對10 倍梯度稀釋的pMD18-DIV1 質粒標準品進行檢測，結果顯示，質粒標準品在3.54×109～3.54×102拷貝/反應范圍內均有較強的熒光信號(圖2a)，說明本研究建立的DIV1的LAMP 檢測方法對質粒模板的檢測下限可低至3.54×102拷貝/反應。在3.54×109～3.54×103拷貝/反應的起始模板濃度范圍內，pMD18-DIV1 起始模板濃度對數值與擴增反應Ct值之間具有良好的線性關系(圖2b)。其關系曲線為Ct=–2.918 Lg(Sq)+39.331，R2=0.996。

圖1 十足目虹彩病毒(DIV1) LAMP 反應體系的優化Fig.1 Optimization of DIV1-LAMP reaction

圖2 十足目虹彩病毒(DIV1) LAMP 方法以pMD18-DIV1 質粒標準品為模板產生的擴增曲線(a)和標準曲線(b)Fig.2 Amplification curve (a) and standard curve (b) of DIV1-LAMP detection method by using pMD18-DIV1 plasmid standard as templates

2.3 DIV1-LAMP 分析特異性檢驗

以DIV1、EHP、VpAHPND、CMNV、IHHNV、WSSV、TSV 和YHV 等主要蝦類病原DNA 或cDNA為模板進行DIV1-LAMP 檢測的特異性分析，結果顯示，只有當檢測樣品含有DIV1 陽性核酸時，擴增反應才產生“S”形擴增曲線，其他病原的核酸均無陽性擴增曲線(圖3)。該結果說明，本研究建立的DIV1-LAMP 方法與上述其他常見的對蝦病原無交叉反應，可特異性檢測DIV1。

圖3 十足目虹彩病毒(DIV1) LAMP 方法的分析特異性Fig.3 Analytical specificity of shrimp hemocyte iridescent virus (DIV1) LAMP assay

2.4 DIV1-LAMP 方法可重復性和可重現性分析

以3.54×109～3.54×103拷貝/反應的pMD18-DIV1質粒標準品為模板，對DIV1-LAMP 檢測方法的可重復性進行評估。結果顯示，在起始模板濃度為3.54×109～3.54×103拷貝/反應的范圍內，DIV1-LAMP檢測方法組內和組間檢測的變異系數CV 分別小于1.89%和1.63% (表2)，說明在此起始模板濃度范圍內該方法穩定性較好。

以3.54×109～3.54×103拷貝/反應的質粒標準品為模板，在3 個不同實驗室環境下進行DIV1 可重現性分析，結果顯示，在上述模板濃度范圍內DIV1-LAMP反應的組間Ct值的P 值均大于0.05 (表3)，說明不同環境下，該方法擴增標準曲線與即時檢測的標準品曲線差異不顯著。說明本研究建立的DIV1-LAMP 方法在不同實驗室環境具有良好的可重現性。

表2 十足目虹彩病毒(DIV1) LAMP 檢測組內和組間重復性Tab.2 Intra-assay and inter-assay variability of DIV1-LAMP assay

表3 DIV1-LAMP 分析法的組間變異性Tab.3 Analysis of variance of inter-assay variability of DIV1-LAMP assay

2.5 DIV1-LAMP 方法對臨床樣品的檢測

本研究對人工感染DIV1 3 d 后的40 尾凡納濱對蝦樣品(編號20191114001～20191114040)分別進行了LAMP 檢測和TaqMan 熒光定量PCR 檢測，結果顯示，2 種方法對病毒載量超過102copies/μl 的樣品定性結果基本一致；而對病毒載量低于102copies/μl 的部分樣品，LAMP 方法檢測結果與TaqMan 熒光定量PCR 檢測結果不一致(表4)，說明本方法不適用于分析DIV1 載量低于102copies/μl 的樣品。

2.6 基于FTA 卡和DIV1-LAMP 方法的對蝦樣品DIV1 現場快速檢測

取4 尾人工感染DIV1 的凡納濱對蝦及2 尾健康凡納濱對蝦，利用Whatman FTA 卡現場制備核酸，將核酸加入內置GeneFinder?、含有DIV1-LAMP 擴增反應預混體系的PCR 小管內進行等溫擴增反應，50 min 后進行顯色，結果顯示，陽性對照和4 尾人工感染DIV1 的凡納濱對蝦樣品對應的PCR 管內呈熒光綠色，為DIV1 陽性，而陰性對照及2 尾健康凡納濱對蝦樣品對應的PCR 管內呈橙紅色，為DIV1陰性(圖4)。該結果說明，利用Whatman FTA 卡進行核酸現場制備，結合核酸染料GeneFinder?預制于擴增反應體系小管內的方法，可以實現對感染DIV1 對蝦的現場快速檢測。

表4 利用DIV1-LAMP 和TaqMan 熒光定量PCR 方法對人工感染DIV1 凡納濱對蝦的檢測結果Tab.4 Detection results of DIV1-LAMP and TaqMan qPCR for L. vannamei samples artificially infected with DIV1

圖4 利用FTA 卡和DIV1-LAMP 方法現場檢測凡納濱對蝦樣品中DIV1 的顯色圖Fig.4 Results of on-site detection of DIV1 in L. vannamei by using FTA card and DIV1-LAMP assay

3 討論

本研究基于DIV1 主要衣殼蛋白基因設計DIV1的LAMP 擴增引物，在優化LAMP 反應溫度、各試劑組分濃度和用量的基礎上建立了DIV1-LAMP 實時熒光檢測技術。本著成本經濟和體系穩定的原則，以求得擴增反應最小Ct值和SD 值為目標，確定優化后的DIV1-LAMP 擴增溫度和反應體系，反應溫度在64.4℃時最佳；優化后的反應體系中的 MgSO4和dNTPs 濃度分別為 4.0 和 1.2 mmol/L，Bst 2.0 WarmStart?DNA 聚合酶和EvaGreen?的用量分別為6.4 U 和0.8 μmol/L。該技術通過Bst 2.0 WarmStart?DNA 聚合酶進行等溫擴增，利用EvaGreen?染料指示反應過程，能夠實現對DIV1 靶基因的實時熒光快速檢測。

以10 倍濃度梯度稀釋的pMD18-DIV1 質粒為模板擴增并構建的標準擴增曲線結果顯示，在3.54×109～3.54×103拷貝/反應的范圍內，起始模板濃度對數值與擴增 Ct值間呈良好的線性關系(R2=0.996)，利用擴增Ct值可準確評估起始模板拷貝數，這表明在該濃度范圍內，本研究所建立的LAMP方法適合作為DIV1 定量檢測的有效工具。前期多項有關 LAMP 實時熒光定量方法的研究顯示，由于LAMP 反應本身的特性，當起始模板濃度<1000 拷貝時，起始模板濃度對數值與擴增Ct值的相關系數明顯降低(Mori et al, 2004; Suzuki et al, 2011; Wei et al,2013; Zhang et al, 2017)。本研究中，DIV1-LAMP 在低拷貝起始模板條件下的定量分析結果與此前的相關報道一致，這也說明DIV1-LAMP 方法不適于對低拷貝(<1000)模板進行準確定量。Qiu 等(2018)基于DIV1 基因組中ATPase 基因(ORF114R)所設計的引物和探針，建立了DIV1 的TaqMan 探針熒光定量PCR方法，該方法于實驗室條件下可在2.5 h 內完成檢測，檢測限低至4 拷貝/反應，可用于DIV1 感染早期的檢測預警，適用于對對蝦苗種、出入境對蝦樣品等進行DIV1 病原的篩查。與已報道的DIV1 TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法相比，本研究建立的DIV1-LAMP檢測方法在實驗室條件下可在50 min 完成反應，檢測時間大大縮短，且成本低廉，可用于發病對蝦(一般攜帶較高拷貝病原)樣品的快速檢測和輔助診斷，適用于水產技術推廣部門、研究單位進行DIV1 流行病學調查的大規模定性或定量檢測。

作者實驗室此前比較了基于DIV1 ATPase 基因和衣殼蛋白基因開發的2 種TaqMan 探針熒光定量PCR 檢測方法，發現上述2 個目標基因對檢測方法靈敏度和特異性的影響很小。本研究對人工感染DIV1的凡納濱對蝦樣品分別進行基于 ATPase 基因的TaqMan 熒光定量PCR 方法和基于衣殼蛋白基因的LAMP 方法檢測，結果顯示，2 種方法對病毒載量低于102copies/μl 的部分樣品的檢測結果不一致，推測其原因可能是由于本研究中所建立的DIV1-LAMP 方法不適用于分析病毒載量低于102copies/μl 的樣品所致。

目前，LAMP 技術在病原檢測領域的應用已十分廣泛，該技術也被用于多種水生動物相關致病細菌、病毒和真菌的檢測中。如Arunrut 等(2016)報道一種以膠體金為探針的LAMP-AuNP 方法，可快速檢測VpAHPND的PirA 基因，檢出限為100 CFU，具有很高的實用價值。Zhang 等(2017)和李小平(2018、2019)分別利用RT-LAMP 技術研發出對蝦偷死野田村病毒和行動障礙野田村病毒(Movement disorder nodavirus,MDNV)的定量檢測方法，并通過將核酸染料添加到反應體系中的方法，使 LAMP 檢測結果可視化。Kumar 等(2018)利用LAMP 方法與Whatman FTA 卡相結合的方法，用于檢測引起對蝦生長緩慢的蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)的SSU rRNA基因，可實現對EHP 的現場快速檢測。基于對蝦養殖者、養殖企業、水產技術推廣部門和研究單位等開展 DIV1 現場快速檢測的需求，本研究在建立DIV1-LAMP 熒光定量方法的基礎上，通過結合Whatman FTA 卡現場制備對蝦組織核酸和顯色染料預置的方法，實現了對DIV1 的現場快速檢測。整個檢測無需PCR 儀等復雜或昂貴的儀器設備，只需溫度計和保溫杯提供恒溫水浴即可完成檢測，檢測過程不超過1 h，單個檢測反應成本相當于TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法的1/10 ～ 1/5。

綜上所述，本研究建立并優化了一種檢測DIV1的LAMP 實時熒光定量檢測方法，其特異性強，速度快，成本低，適用于在實驗室內對患病對蝦進行DIV1 的快速檢測或輔助診斷。同時，本研究還將Whatman FTA 卡核酸現場制備方法與DIV1-LAMP方法相結合，進一步開發了DIV1 的現場快速高效檢測技術，適用于開展養殖對蝦的DIV1 現場快速檢測。本研究為DIV1 這一新發蝦類病原提供了可靠的檢測方法，對實現低成本、大規模、快速DIV1 檢疫，以及控制該病毒性疫病的傳播和流行具有重要意義。

致謝：中國水產科學研究院黃海水產研究所養殖生物疾病控制與分子病理學研究室研究生協助DIV1感染對蝦取樣和核酸提取，謹致謝忱。