基于全長轉(zhuǎn)錄組測序的金烏賊微衛(wèi)星位點篩選與特征分析*

張金勇 何暮春 項子龍 柳淑芳① 莊志猛

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 青島 266071；2. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071；3. 南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院 無錫 214081；4. 中國海洋大學海洋生命學院 青島 266003；5. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306)

金烏賊(Sepia esculenta Hoyle, 1885)俗稱墨魚或烏魚，主要分布于中國沿海海域、日本北海道以南、朝鮮西南海域及菲律賓群島海域(Okutani, 1995)。金烏賊是一種具有較高經(jīng)濟價值的優(yōu)良品種，曾是我國渤、黃海重要捕撈對象。然而，20 世紀80 年代以來，由于過度捕撈、棲息地破壞等原因，金烏賊資源急劇衰退(郝振林等, 2007)。金烏賊具有營養(yǎng)豐富、生長迅速、個體大(均重700 g)、生命周期短(約1 年)、世代更新快和洄游規(guī)律性強等特點，為保護和恢復金烏賊資源，我國學者在金烏賊基礎(chǔ)生物學、增養(yǎng)殖技術(shù)及種群遺傳學等方面開展了系列研究(鄭小東等,2002、2003; 趙厚鈞等, 2004; 郝振林等, 2008; 韓松等,2010; Zheng et al, 2007、2009)，并于2010 年突破了金烏賊人工繁育和增殖放流技術(shù)(佚名, 2010)。為更好地開展金烏賊繁育及增殖養(yǎng)護工作，有必要從分子層面精準評估現(xiàn)有種群的種質(zhì)狀況和遺傳多樣性。

簡單重復序列(Simple sequence repeat, SSR)分子標記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星DNA 序列標記，其串聯(lián)重復的核心序列為1～6 個核苷酸(Powell et al, 1996;Toth et al, 2000)。作為一種遺傳標記，SSR 廣泛存在于原核和真核生物基因中，具有重復性好、共顯性高、穩(wěn)定性強、多態(tài)性豐富等特點(Tuler et al, 2015)。按照SSR 的來源，可分為表達序列標簽SSR (EST-SSR)和基因組SSR(g-SSR)。近年來，相對于傳統(tǒng)的ESTSSR 開發(fā)，通過轉(zhuǎn)錄組測序平臺開發(fā)SSR 標記已在多種水產(chǎn)動物中得到應用。本研究在金烏賊Pacific Biosciences 單分子實時(Single-molecule real-time,SMRT)測序技術(shù)和Illumina RNA-Seq 技術(shù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得生物學數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上，利用Micro Satellite(MISA)軟件篩選SSR 位點并分析其分布及組成特征，以期為后續(xù)的金烏賊群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀QTL 定位和良種選育等研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物材料

實驗用金烏賊于2017 年1 月～7 月取自青島金沙灘水產(chǎn)開發(fā)有限公司，挑選體形完整，無傷害的個體。分別從生長(約6 月齡)、產(chǎn)卵(10～11 月齡)和產(chǎn)后瀕死(11～12 月齡)三個關(guān)鍵時期隨機選擇3 個雌性金烏賊親體。從選擇的雌性個體解剖腦亞腳葉/嗅葉、視腺、卵巢和纏卵腺組織樣品，浸沒在RNAlater(天根, 中國)中，并于–80℃儲存。

1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

提取金烏賊不同時期的腦亞腳葉/嗅葉、視腺、卵巢和纏卵腺組織樣本的總RNA，送天津諾禾致源生物信息科技有限公司，采用PacBio SMRT 測序技術(shù)和Illumina RNA-Seq 技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過整合PacBio SMRT 和Illumina 測序數(shù)據(jù)，生成高質(zhì)量的金烏賊轉(zhuǎn)錄組，包含177,951 條全長轉(zhuǎn)錄本(Zhang et al, 2019)，以此作為分析數(shù)據(jù)。

1.3 金烏賊EST-SSR 的篩選

為檢測金烏賊的SSR 位點，利用MISA(v1.0) (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)對其Unigene 序列進行分析。SSR 位點包含了單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸以及六核苷酸重復。判斷的標準為單核苷酸重復至少12 次；二核苷酸重復至少6 次；三核苷酸重復至少5 次、四核苷酸重復至少5 次、五核苷酸重復至少4 次、六核苷酸重復至少4 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 金烏賊轉(zhuǎn)錄組SSR 位點數(shù)量與分布

金烏賊轉(zhuǎn)錄組測序共獲得177,951 條全長轉(zhuǎn)錄本，序列總長度為198,175,926 bp。檢索Unigene 序列，共發(fā)現(xiàn)161,327 個SSR 位點，分布在64,933 條Unigene 中，發(fā)生頻率(含SSR 的Unigene 數(shù)與Unigene總數(shù)之比)為36.49%，出現(xiàn)頻率(SSR 數(shù)目與Unigene總數(shù)之比)為90.66%，平均每1,228 bp 含有1 個SSR位點。此外，有33,136 條Unigene 含超過1 個SSR位點，33,260 條Unigene 含有復合型SSR(表1)。

金烏賊EST-SSR 類型豐富，從表2 可以發(fā)現(xiàn)，單核苷酸到四核苷酸重復最多，占總SSR 位點數(shù)量的99.55%，其中，單核苷酸和二核苷酸所占的比例較大，分別占總數(shù)的46.00%和39.93%；其次為三核苷酸和四核苷酸，分別為9.48%和4.14%。五、六核苷酸重復率總計0.448%，數(shù)量很少。

2.2 金烏賊SSR 重復基元的序列組成

金烏賊SSR 中，單核苷酸重復以A/T 重復基序最多，占總SSR 的44.79%；二核苷酸重復以AT/AT和AC/GT 重復基序為主要類型，共占SSR 總數(shù)的34.73%；三核苷酸重復則以AAT/ATT 和ATC/ATG出現(xiàn)頻率最高，共占 4.71%；四核苷酸重復則以AAAG/CTTT 居多，AGAT/ATCT 次之。其他五核苷酸和六核苷酸重復基元類型較多，數(shù)量非常少，出現(xiàn)頻率很低，見表3。

表2 金烏賊EST-SSR 不同重復基元分布情況Tab.2 Distribution of different repeat motifs in S. esculenta

表3 金烏賊EST-SSR 重復基元的類型Tab.3 Type of EST-SSR repeat motifs in S. esculenta

2.3 金烏賊轉(zhuǎn)錄組中的SSR 重復次數(shù)

重復片段的長度會影響SSR多態(tài)性，而SSR重復次數(shù)可以決定重復片段的長度。金烏賊SSR的堿基重復次數(shù)很廣泛，整體波動在5～100次范圍內(nèi)，多集中于5～29次。單核苷酸重復12～102次；二核苷酸重復6～50次；三核苷酸重復5～24次；四核苷酸重復6～19次；五核苷酸重復6～19次；六核苷酸重復6～12次。重復12次的頻率最高，共有18,289條，占總SSR數(shù)的11.34%，其次是重復6次(10.98%)、13次(7.73%)、7次(6.82%)、14次(6.28%)，30次以上(含30)占3.40%。總體上，金烏賊轉(zhuǎn)錄組SSR的重復次數(shù)以11～20次最多，占總SSR比例為47.92%，4～10次次之，為35.03%；重復次數(shù)21～30次為14.24%；重復次數(shù)大于30次為2.80% (圖1)。

圖1 金烏賊轉(zhuǎn)錄組EST-SSR 不同重復基元的重復次數(shù)Fig.1 Repeat numbers of EST-SSR with different motifs in transcriptome of S. esculenta

2.4 金烏賊轉(zhuǎn)錄組SSR 的長度

SSR位點中重復基元的長度是影響其多態(tài)性高低的重要因素，當SSR≥20 bp時，其多態(tài)性高；重復基元長度12≤SSR＜20 bp時，多態(tài)性中等；而低于12 bp時，多態(tài)性極低。本研究中去除了12 bp以下的SSR，長度≥12 bp的SSR共有161,327個。從金烏賊轉(zhuǎn)錄組中SSR基元長度分布情況可以看出，其中，重復基元長度在12～19 bp的SSR位點最多，共有95,323個，占SSR總數(shù)的59.09%；其次為20～30 bp，共有43,977個，占SSR總數(shù)的27.26%；長度在31～40 bp的，共10,931個，占SSR總數(shù)的6.78%；長度在41～ 50 bp的，共5,588個，占SSR總數(shù)的3.46%；基元長度大于50 bp的數(shù)量最少，共5,508(3.41%)。根據(jù)該結(jié)果，可推測該研究中Ⅱ型SSR(長度為12～20 bp)的SSR的比例為59.09%，具有中等多態(tài)性，有較高的潛在可用性。而具有高度多態(tài)性的I型SSR(長度≥20 bp)中，含有低級基元(二、三核苷酸重復)SSR位點數(shù)量占優(yōu)，這部分SSR位點具有豐富的多態(tài)性(圖2)。

圖2 金烏賊轉(zhuǎn)錄組SSR 位點重復基元序列長度分布頻率Fig.2 Frequency of SSR repeat sequence length distribution in transcriptome of S. esculenta

3 討論

本研究以金烏賊轉(zhuǎn)錄組信息對其EST-SSR 進行開發(fā)。結(jié)果顯示，金烏賊轉(zhuǎn)錄組中含有豐富的SSR位點。從金烏賊轉(zhuǎn)錄組的177,951 條Unigene 中，共搜索出161,327 個SSR，分布在64,933 條Unigene 中，SSR 的出現(xiàn)頻率為90.66%。與其他水生動物SSR 的出現(xiàn)頻率相比，明顯高于扁玉螺(Neverita didyma)(86.53%) (盧瑋筱等, 2018)、黃姑魚(Nibea albiflora)(39.30%) (龔詩琦等, 2016)、翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)(27.51%) (袁文成等, 2015)、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii) (45.91%) (王傳聰?shù)? 2018)、無針烏賊(Sepiella japonica) (48.70%) (呂振明等, 2017; 管奧等,2018)、馬氏珠母貝(Pinctada martensii) (13.34%)(王忠良等, 2015)、櫛江珧(Atrina pectinata) (8.2%)(李東明等, 2017)、縊蟶(Sinonovacula constricta)(8.89%) (劉博等, 2012)、泥蚶(Tegillarca granosa)(14.83%) (周小龍等, 2013) (表5)。

SSR 檢索標準、數(shù)據(jù)庫豐富程度以及物種差異，都會影響SSR 的出現(xiàn)頻率(Varshney et al, 2005)。如張秀英等(2012)采用不同檢索條件從櫛孔扇貝BES文庫篩選SSR，表明SSR 出現(xiàn)頻率隨檢索標準的提高而降低。數(shù)據(jù)庫豐富程度也會影響EST-SSR 位點出現(xiàn)頻率，石耀華等(2008)和王忠良等(2015)先后從馬氏珠母貝6,979 和74,007 條EST 序列中篩選得到243 和9,872 個EST-SSR 位點，位點出現(xiàn)頻率分別為3.48%和13.34%。Franklin 等(2005)和王艷紅等(2011)對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)不同數(shù)量的EST序列進行EST-SSR 篩選，其出現(xiàn)頻率分別為4.9%和7.8%。

表5 目前已獲得EST-SSRs 出現(xiàn)頻率的部分水生動物Tab.5 Some aquatic animals that have obtained the frequency of EST-SSRs

大量研究表明，在已開發(fā)的EST-SSR 標記中，二核苷酸和三核苷酸重復基元類型最為豐富。蝦夷扇貝和櫛江珧的EST-SSR 均以二核苷酸重復基元所占比例最高，分別占40.54%和77.08% (李云峰等, 2010;李東明等, 2017)；縊蟶SSR 以三核苷酸重復SSR 比例最高，為37.13% (劉博等, 2012)。本研究發(fā)現(xiàn)，金烏賊EST-SSR 重復類型中，以單核苷酸重復基元最多，比例達到46.00%，其次為二核苷酸，為39.93%。這和無針烏賊(呂振明等, 2017)、馬氏珠母貝(王忠良等, 2015)、羅氏沼蝦(王傳聰?shù)? 2018)和扁玉螺(盧瑋筱等, 2018)中單核苷酸重復基元是主導類型的研究結(jié)果相似。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，金烏賊轉(zhuǎn)錄組中，SSR位點最多的是單核苷酸的重復基元A/T，占總SSR 的44.79%；其次為二核苷酸的AT/AT 和AC/GT，共占SSR 總數(shù)的34.73%。此外，金烏賊轉(zhuǎn)錄組SSR 位點重復基元序列長度在20 bp 以上的SSR 位點共有66,004 個，占SSR 總數(shù)的40.91%，并且其中含有低級基元(二、三核苷酸重復) SSR 位點數(shù)量占優(yōu)，這部分SSR 可能具有較高的利用價值。

4 結(jié)論

整體而言，金烏賊轉(zhuǎn)錄組SSR 出現(xiàn)頻率較高且類型豐富，共檢測出161,327 個SSR 位點，分布在64,933 條Unigene 中，SSR 位點發(fā)生頻率為36.49%，出現(xiàn)頻率高達90.66%。這些SSR 在提高物種遺傳多樣性潛能方面發(fā)揮著重要的作用。研究結(jié)果為下一階段開發(fā)金烏賊多態(tài)性SSR 分子標記提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為開展金烏賊種質(zhì)資源保護利用、遺傳多樣性評價和未來分子標記輔助育種等研究奠定基礎(chǔ)。