草魚仔魚耳石茜素絡合物標記特征研究*

朱亞華 姜 濤 陳修報 劉洪波 楊 健,①

(1. 南京農業大學無錫漁業學院 無錫 214081；2. 中國水產科學研究院長江中下游漁業生態環境評價與資源養護重點實驗室 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心 無錫 214081)

草魚(Ctenopharyngodon idellus)是“四大家魚”之一，在我國淡水漁業經濟中占據著舉足輕重的地位。近年來，由于生境破壞、水利設施的修建、過捕等因素，其天然資源急劇下降(沈玉幫等, 2011)。為達到漁民增收、資源恢復等目標，國家實施了大規模增殖放流的政策，草魚屬農業部《關于“十三五”水生生物增殖放流工作指導意見》中的主要品種。值得注意的是，一些傳統標記方法受到很多限制，如切鰭法只適用于短期標志；掛牌法主要適用于大型魚類(羅新等,2011)；分子標記成本高且檢測相對復雜(李樹華等,2014)等。因此，探索適合草魚(特別是魚苗)增殖放流標記和評價方法刻不容緩。

耳石存在于大多數硬骨魚類的內耳的膜迷路內，有矢耳石、微耳石和星耳石3 種類型，對魚類的聽覺和身體的平衡有重要的作用(Campana, 1999)。耳石標記常用的熒光物質包括鹽酸四環素(Tetracycline hydrochloride, TCH)、土霉素(Oxytetracycline, OTC)、鈣黃綠素(Celcein, CAL)、茜素紅S(Alizarin red S)和茜素絡合物(Alizarin complexone, ALC)，其中，ALC使用最廣且效果較好(宋昭彬等, 1999; 付自東等,2005)。此前，草魚耳石的研究多集中在形態比較及類群判別(宋昭彬等, 2003a、b; 曾祥波等, 2012)、年齡鑒定及與生長的關系(宋昭彬等, 2001b; 李建軍等,2010)、孵化期推算(管興華等, 2007; 張國等, 2013)等方面，尚未見有相關化學標記研究。本研究利用ALC 對草魚仔魚的耳石進行標記，探討此方法對該魚種的適用性，為今后草魚相關的大規模標記提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗在中國水產科學研究院淡水漁業研究中心南區實驗基地開展。實驗所用的仔魚苗由基地于2019 年5 月19 日采購(3 日齡)。根據陳真然(1963)的劃分標準，將其歸為仔魚(圖1)。魚苗采購后，置于裝有經48 h 曝氣自來水的玻璃缸(長×寬×高為100 cm ×45 cm×50 cm)中暫養。暫養過程中投喂蛋黃水，每日投喂2 次，每日清理魚體排泄物及換水1 次，換水量為養殖水體的1/4。隨機選取規格基本一致[平均全長為(8.31±1.21) mm，平均體重為(0.06±0.02) g]的草魚仔魚，放入桶中作為供試魚，于2019 年5 月25 日開始茜素絡合物(ALC)標記實驗，標記期間不喂食，浸泡標記24 h 后，移到恢復養殖缸(長×寬×高為50 cm×50 cm× 40 cm)中進行養殖，在恢復養殖期間，前期繼續投喂蛋黃水，待草魚達到30 日齡后開始投喂粉狀普通配合飼料，每日投喂2 次，每日清理魚體排泄物及換水1 次，換水量占養殖水體的1/4。在暫養及整個實驗期間均正常充氣增氧，水溫在23～32℃之間，自然光照，不控光周期。

圖1 本研究所用草魚仔魚及其3 類耳石Fig.1 The larval Ctenopharyngodon idellus and its three types of otoliths

1.2 實驗方法

本研究的茜素絡合物購自生工生物工程(上海)股份有限公司，包裝規格為1 g/瓶。實驗分為2 個階段，第1 個階段為浸泡標記階段。參考邱晨等(2018)的方法，使用茜素絡合物對鯉(Cyprinus carpio)仔魚的浸泡濃度，實驗設置對照組及標記組(100 mg/L)，各組隨機選擇100 尾魚進行24 h 浸泡實驗。浸泡標記期間，統計12、24 h 對照組及標記組的個體急性死亡情況。第2 個階段為恢復養殖階段。浸泡標記結束后，將標記組實驗魚移出，放到恢復養殖缸中繼續養殖。本研究樣本采集分為2 個階段，在恢復養殖的0～40 d中，標記組和對照組每5 d 定期取樣，每次取樣5 尾，以設置樣本重復。取至第40 天后，每10 d 取樣1 次，同樣每次取樣5 尾，以確保樣本重復，直至取樣到第60 天結束。取樣之后，利用電子天平測量其體重，電子游標卡尺測量其全長(數據分別精確至0.001 g 和0.01 mm)。0～20 d 的樣品先保存在100%無水乙醇中，然后置于4℃的冰箱中冷藏，25～60 d 的樣品直接放入自封袋中，于–20℃冰箱中冷凍。在恢復養殖期間，統計標記組和對照組死亡數，并及時移出死魚。

1.3 耳石樣品的摘取、制備及檢測方法

將樣本魚置于載玻片上，放于解剖鏡下，用解剖針將耳石從聽囊中快速取出。先用去離子水清洗去除耳石表面的雜質及黏液，然后用無水乙醇脫水、干燥，使用電子探針微區分析儀(JXA-8100，日本電子株式會社)對3 類耳石形態進行掃描拍照(圖1)。參考邱晨等(2018)對鯉仔魚熒光標記的處理措施，使用無色透明指甲油將耳石包埋固定在載玻片上(無需打磨)，待指甲油凝固后，避光保存(St?ter et al, 2019)。在OLYMPUS BX51 型顯微鏡(日本)的可見光、藍色激發光(WBS)和綠色激發光(WGS)下對其進行觀察，比較最適光源，并利用顯微鏡自帶的Stream start 軟件進行圖譜拍照和圖像處理。在進行耳石浸泡標記的時滯觀察時，先將耳石打磨至露出核心，再在其表面用無色透明指甲油二次固定。使用OLYMPUS BX51 型顯微鏡對耳石日輪數目進行計數。耳石標記效果參照歐陽斌等(1999)的方法按無(–)、微弱(+)、較明顯(++)、明顯(+++)和非常明顯(++++) 5 個等級進行記錄。

1.4 數據分析

利用Excel 2010 對數據進行統計分析和制圖。同時，利用SPSS 23.0 軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，對實驗魚生長差異進行顯著性分析，設定差異顯著性水平為P<0.05。

2 結果

2.1 ALC 標記對草魚仔魚生存及生長的影響

在24 h 的ALC 浸泡過程中，實驗組和對照組均未出現死亡，存活率為100%。在浸泡過程中，標記組仔魚的游泳能力正常，沒有表現出任何異常行為，說明100 mg/L 的ALC 標記對草仔魚產生的影響較小或者未產生影響。浸泡標記24 h 后，移到恢復養殖缸中繼續養殖。在恢復養殖的0～60 d 內，統計標記組和對照組的死亡數，截止第60 天取樣，標記組死亡2 尾，對照組死亡9 尾，樣本數統計不包括死亡數。

隨著恢復養殖天數的增加，魚體發生明顯變化，各個器官逐漸發育完全，接近成魚。觀察發現，標記組和對照組在魚體發育的成熟度上沒有明顯差異，其攝食和游泳能力均正常。對樣本的平均體重及平均全長計算可以看出(圖2)，草魚仔魚的體重及全長隨恢復養殖天數增加而逐漸增加。同時，0～10、20～40 d標記組與對照組的平均體重存在顯著差異(P<0.05)，15、50、60 d 標記組樣本魚的平均體重與對照組差異不顯著(P>0.05)。5～10、20～35 d 標記組與對照組的平均全長差異顯著(P<0.05)，0、15、40～60 d 標記組樣本魚的平均全長與對照組差異不顯著(P>0.05)。綜合來看，標記組和對照組的平均體重及平均全長的差異性呈無規律性。

圖2 不同取樣天數標記組和對照組草魚仔魚的平均體重和平均全長變化(n=5)Fig.2 Changes of average body weight and average total length of larval Ctenopharyngodon idellus of the marking group and control group at different sampling day (n=5)

2.2 茜素絡合物浸泡標記草魚仔魚耳石效果檢測

2.2.1 草魚仔魚3 類耳石的ALC 浸泡標記效果 在熒光顯微鏡的可見光及2 種激發光源下觀察草魚仔魚矢耳石、微耳石和星耳石的標記效果，發現草魚仔魚微耳石的標記效果最好，矢耳石次之(圖3)。微耳石的形狀為橢圓形，經過ALC 浸泡標記過的耳石在其上面形成了一個明顯的橘紅色標記環，且微耳石的日輪輪紋清晰，在顯微鏡的可見光下，能清楚地計數日輪數目。同樣，矢耳石的標記環也清晰可見，形狀為箭矢形，具有中間厚兩端薄的特點，隨著生長天數的增加，觀察到的標記環逐漸模糊。在本實驗中，星耳石的熒光標記結果有2 種，一種是耳石的標記部分表現為一個小點或一個小環，另一種是觀察不到任何標記現象。因此，草仔魚微耳石的熒光標記效果最佳，是觀察草魚仔魚標記效果的理想選擇。以下內容以微耳石為依據進行比較。

圖3 恢復養殖第20 天時草魚仔魚矢耳石、微耳石和星耳石分別在可見光、藍色激發光和綠色激發光下的標記效果Fig.3 The marking effect of sagitta, lapillus and asteriscus of larval Ctenopharyngodon idellus under visible, blue excitation and green excitation lights at the 20th day of recovery culture after ALC immersion

2.2.2 微耳石經ALC 浸泡標記后在3 種光源下的信號檢測效果 在可見光、藍色激發光和綠色激發光下，對微耳石進行拍照觀察，發現標記強度明顯不同(表1)。所有微耳石在可見光、藍色激發光和綠色激發光下，均能看到1 個明顯的標記環，但三者對標記產生的顏色反應不同(圖3)。在可見光下，ALC 浸泡過后在耳石上看到一個深紅色的標記環，但隨著恢復養殖天數的增加，深紅色標記環的顏色逐漸變淡，甚至完全觀察不到。在藍色激發光下，微耳石上形成一個橘紅色的標記環，與沒有標記的綠色部分形成強烈反差，顏色鮮艷，容易觀察。在綠色激發光下，ALC浸泡過后，耳石上形成一個深紅色的標記環，沒有被標記部分呈淡橘紅色，二者顏色相近，容易造成混淆，且標記環與未標記部分界線不容易區分，對于識別準確的標記日輪產生一定的干擾。因此，對于草魚仔魚熒光標記來說，藍色激發光為較理想的觀察光源。

2.2.3 不同恢復養殖天數草魚仔魚微耳石在藍色激發光下的ALC 標記檢測效果 觀察不同恢復養殖天數下的微耳石(圖4)可以看到，熒光標記信號強度呈先增強后減弱的趨勢。在第0 天取樣時，即浸泡完成當天取樣，就能在耳石上觀察到一個明顯的標記環，且標記環清晰，說明ALC 在浸泡當日就在耳石上積累形成了標記。第5 天時，已能看到耳石標記環外面的新區域，與標記環里的區域形成強烈反差，標記環觀察更為清晰。第10～40 天的耳石標記環強度基本沒有發生變化，熒光信號強度穩定，為最佳觀察時間段。但從第50 天和第60 天的耳石標記強度來看，熒光信號強度有下降趨勢，標記環略模糊，但仍然具有很強的可見性。

表1 草魚仔魚微耳石在3 種不同光源下的檢測效果Tab.1 Detection effect of lapillus of larval Ctenopharyngodon idellus under three different light sources

圖4 不同恢復養殖天數下草魚仔魚微耳石在藍色激發光下ALC 標記效果比較Fig.4 Comparison of ALC marking effect on lapillus of larval Ctenopharyngodon idellus at different day of recovery culture

2.3 草魚仔魚經ALC 浸泡后耳石標記出現和消失的時滯

以浸泡標記第5 天的微耳石為例(圖5)，在顯微鏡下，3 種可見光下的耳石相同位置上能觀察到顏色不同的標記環。在可見光下對耳石的部分進行放大，觀察日輪并計算耳石熒光信號標記出現和消失的時滯。由于草魚仔魚的日齡為生長輪數目加1(宋昭彬等,2001)，因此，具有第一日輪的草魚為2 日齡，完整的日輪由明帶和暗帶共同組成。草魚仔魚浸泡當日為9 日齡，開始浸泡標記時間為17:00，此時，第8 日輪的明帶已經形成，暗帶開始形成；而浸泡結束時草魚仔魚為10 日齡，此時，第9 日輪的明帶已經形成，暗帶尚未形成。從耳石的熒光標記環來看，耳石的熒光標記信號在第9 日輪的明帶和暗帶上，在第9 日輪前后都無熒光信號出現。即在浸泡當晚，耳石第8 日輪暗帶形成的過程中，熒光物質并沒有隨著碳酸鈣進入耳石，即為浸泡開始與標記出現的時滯，約12 h。當浸泡完成后，第9 日輪的暗帶開始形成，此時，仔魚已經不處于熒光物質溶液中，其上面存在的熒光標記信號即為浸泡結束與標記消失的時滯，約12 h。因此，熒光標記環的產生和消失與浸泡的開始和結束均存在約12 h 的時滯。

圖5 恢復養殖第5 天時草魚仔魚微耳石標記環出現和消失時滯推算Fig.5 The time lag for the appearance and disappearance of ALC marker ring in the lapillus of larval Ctenopharyngodon idellus at the 5 d recovery culture

3 討論

3.1 草魚仔魚3 對耳石標記差異性特征

曾祥波等(2012)研究發現，草魚的矢耳石和微耳石在魚體孵化時便已存在，而魚體的星耳石則在第12 天出現，相對較晚，此現象在各種不同種類的魚體存在(付自東等, 2005; 趙亞鵬等, 2013)。由于3 對耳石在生長階段變化的差異性，先前的研究對象主要集中在微耳石和矢耳石上(宋昭彬等, 2003a、b; 徐永江等, 2016; 付自東等, 2005)，星耳石的研究較少。草魚仔魚的矢耳石在剛孵化的時候為圓形，隨著日齡的增加，逐漸向兩端生長，變成兩端薄中間厚的箭矢形；微耳石最初的形狀為圓形，此外，還觀察到部分微耳石的2 個核心緊緊相鄰，其日輪清晰，便于觀察，隨著日齡的增加，耳石逐漸生長為橢圓形。在本研究中，浸泡當日仔魚為9 日齡，浸泡24 h 之后為10 日齡，故仔魚的星耳石尚未發育出來，在觀察中看不到熒光物質留下的標記環，但部分個體的星耳石上又能觀察到一個微弱的橘紅色標記環，說明在浸泡當日有部分個體已經發育出了星耳石，發育之后星耳石為一豆形，其核心十分模糊，不具有一個明顯的原基，但隨著日齡的增加，星耳石逐漸發育完全，形狀逐漸規則，向圓形過渡，輪紋清晰。本研究中所有樣本魚理論上處于同一發育日齡，由于魚體新陳代謝的差異，不能完全保證所有魚體具有完全一致的胚胎孵化周期(St?ter et al, 2019)，因此，不同的魚苗日齡之間存在偏差，故能在極個別的樣本魚的星耳石上看到微弱的標記環。還有一種可能是星耳石的發育存在個體差異，受外界環境的影響，比如水溫、營養、壓力等，部分個體加快了其形成時間。

ALC 標記環能夠長期存在于耳石上，但隨著時間的增加，標記環會逐漸模糊(王正鯤等, 2015)，特別是在可見光下看到的深紅色標記環(邱晨等, 2019)。何春林等(2008)在對重口裂腹魚(Schizothorax davidi)進行ALC 標記時，在可見光下觀察到的標記環也較微弱。在本研究50 d 和60 d 的樣本中，在可見光下幾乎看不到此標記環，而在藍色激發光和綠色激發光下依然能夠清晰地看到，但沒有前期的標記環清晰。這可能是由于恢復養殖時間過長，新的日輪在不斷形成，耳石在不斷變大，厚度增加而減弱了熒光的穿透性(Iglesias et al, 1997; Noda et al, 2013)。另外，進行浸泡標記時，魚體年齡很小，標記日輪靠近中心，之前經過標記的日輪與后面長出來的新的日輪形成對比，長出的區域越多，顯得標記環越小，也增加了標記檢測的難度。司飛等(2019)對牙鲆(Paralichthys olivaceus)進行鍶標記時發現，隨著標記部分所占比重的減少，某種程度可能會影響耳石上鍶標記的檢出效果。

3.2 草魚仔魚耳石ALC 標記環出現和消失的時滯特征

ALC 對多種魚類均有較好的標記效果(Vigliola,1997; Skov et al, 2001; Liu et al, 2009; 趙亞鵬等,2013; Lü et al, 2014)。但關于浸泡開始和結束與熒光標記信號的產生和消失是否存在時間差的研究卻很缺乏。邱晨等(2018)通過對鯉仔魚的觀察發現，其熒光標記信號的產生和消失與浸泡開始和結束的時間均有1 d 的時滯。在本研究中，熒光標記環的產生和消失與浸泡的開始和結束均存在約12 h 的時滯。這可能與不同種類的魚具有不同的代謝速率有關。熒光標記在魚類耳石中沉積的原理是魚的新陳代謝促使熒光物質隨著碳酸鈣進入耳石，參加下一輪的碳酸鈣沉積，隨著時間的增加，帶有熒光物質的碳酸鈣積累越來越多，逐漸形成一個熒光標記環(徐永江等,2016)。魚苗的日齡越低，其新陳代謝速率越快，仔魚的代謝速率要高于稚魚和成魚。本研究浸泡當日的魚苗為9 日齡，正處于代謝旺盛的時期，對熒光物質具有較好的吸收，熒光物質隨著碳酸鈣一起沉積在耳石上，形成了肉眼可見的標記環。在進行時滯觀察時，由于日輪中還存在部分亞日輪，會影響日輪的正確計數，在進行時滯觀察前，需要先將耳石進行打磨，直至暴露出核心為止。姜濤等(2016)在對刀鱭(Coilia nasus)耳石幾種前處理方法所得年輪的觀察中發現，橫截面法比矢狀面法更有優勢。在本研究中，打磨后的耳石矢狀面已經能直接清晰地看到日輪，并且無需酸蝕。打磨之后進行拋光，再用無色透明指甲油進行二次包埋，增加耳石的透光性，即可得到較為準確的日輪數目。

3.3 草魚仔魚耳石ALC 標記實驗條件的特征

對于本研究中的草魚仔魚來說，在100 mg/L 的ALC 溶液中浸泡標記24 h，經無色透明指甲油包埋的耳石(無需打磨)可以明顯觀察到熒光標記，能取得理想的效果。對比可見光和不同熒光下不同耳石的標記效果，發現微耳石是檢測熒光標記最適宜的耳石類型，且在藍色熒光下觀察效果最佳。邱晨等(2018)對鯉仔魚的浸泡時間選為48 h，在本研究中對浸泡時長進行了優化，選擇24 h 作為草魚仔魚的浸泡時長，以期能在較短時間下獲得理想的熒光標記效果，減少熒光物質浸泡對魚苗的傷害，節約成本。同時，在經過長達60 d 的恢復養殖后，仍能取得不錯的熒光標記效果。熒光標記一般用來標記仔魚(Yang et al, 2016)，考慮到魚體生理脅迫的耐受力及魚體發育的差異性，不同種類、不同規格魚體的最佳浸泡濃度和浸泡時間也不一樣，而浸泡濃度的多少和浸泡時間的長短對標記效果有著決定性的作用(王正鯤等, 2015; 何春林等,2008; 趙亞鵬等, 2013)。本研究中，由于草魚仔魚剛孵化時，星耳石尚未發育(曾祥波等, 2012)，即使發育之后星耳石的核心也十分模糊。標記初期如果正好在星耳石產生之時，則標記環相對模糊，但邱晨等(2018)研究表明，星耳石是鯉仔魚熒光標記的最佳選擇，從極個別草魚仔魚已經發育出來的星耳石上的標記環也可以看出，一旦星耳石發育形成，ALC 標記同樣對星耳石具有很好的適用性，能夠在其上形成標記環。如果使用星耳石來觀察熒光標記，研究星耳石從何時開始生長且到何時開始長出清晰且有規律的生長是重要環節。在進行熒光標記實驗的過程中，不僅僅是區分到仔稚魚，根據耳石形成的特點具體到某日齡的魚進行標記能夠得到更好的效果。因此，在下一步工作中，作者將進行不同日齡的草魚在不同濃度茜素絡合物和不同浸泡時間下的比較研究，以便確定最適的浸泡規格、浸泡時間及浸泡濃度，同時，標記之后將進行更長期的養殖觀察以確定其持久性。

4 結論

本研究首次通過100 mg/L 的茜素絡合物對草魚仔魚進行1 d 浸泡實驗，獲得了理想的標記結果。在可見光、藍色激發光和綠色激發光下，在3 種耳石上均能觀察到明顯的標記環，其中，微耳石的標記效果最好，矢耳石次之；藍色激發光的檢測效果最佳，綠色激發光次之；在可見光下，耳石日輪數目的觀察清晰度最高。魚體浸泡開始和結束的時間與熒光標記環出現和消失的時間均存在約12 h 的時間差，同時，在長達60 d 恢復養殖的情況下，仍然能在耳石上檢測到明顯的標記環。相關結果能夠對今后草魚仔魚的增殖放流工作效果的有效評估提供理論參考、技術支撐以及條件優化的思路。