固相萃取-液相色譜串聯質譜法測定番茄中春雷霉素的殘留量

楊 梅

（上海天祥質量技術服務有限公司食品部，上海 200233）

春雷霉素（kasugamycin），又名春日霉素、加收米、加瑞農等，是一種農用抗生素類殺菌劑，具有極強的內吸滲透性，對真菌和細菌都有很好的預防和治療效果。自研發以來，其在亞洲和南美洲就被廣泛應用于農業，對水稻稻瘟病、番茄葉霉病、馬鈴薯環腐病、黃瓜和西瓜細菌性角斑病等具有很好的防治效果。春雷霉素對人畜無毒、低殘留、無污染，符合現代化環保要求[1]，是目前應用較為普遍的一種理想殺菌劑。

目前，國內的農藥殘留限量標準GB 2763—2019《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》對春雷霉素的殘留限量有了明確的規定。該標準已于2020年2月正式生效，標準中規定春雷霉素在番茄中的最大臨時限量為0.05 mg/kg[2]。春雷霉素為易溶于水的強極性物質，在液相色譜上保留時間較短，使得對其的分離和分析有一定難度[3]。目前春雷霉素的檢測方法尚沒有相應的國家標準及行業標準，相關文獻也較少[4-6]，有關番茄中春雷霉素的殘留檢測方法也很少。筆者通過優化色譜、質譜條件，建立了用固相萃取-液相色譜-串聯質譜聯用技術測定番茄中春雷霉素的方法，供相關人員測定番茄中春雷霉素殘留時做參考。

1 實驗器材與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

液相色譜串聯質譜儀、HILIC色譜柱（150 mm×3.0 mm），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；BH600分析天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司；攪拌機，飛利浦（中國）投資有限公司；SF-DL-4M冷凍離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；SK3300HP超聲波提取儀，上海科導超聲儀器有限公司；DC-12H氮吹儀，上海安譜科學儀器有限公司；渦旋混合器，上海醫大儀器有限公司；FJ-200高速分散均質機，上海標本模型廠；57044固相萃取儀，美國色譜科公司。

1.1.2 試劑和耗材

超純水，美國密里博公司；乙腈（色譜級）、甲醇（色譜級）、甲酸（色譜級），美國ACS恩科化學有限公司；氨水（分析純），上海國藥集團；PCX混合陽離子交換固相萃取柱（60 mg/3 mL），天津博納艾杰爾科技有限公司；高純度氮氣（純度99%）、高純度氬氣（純度99%），上海液化空氣集團。

1.1.3 標準物質

春雷霉素鹽酸鹽（kasugamycin hydrochloride），CAS為19408-46-9，分子式為C14H26ClN3O9，分子量為415.824。標準物質購自Dr.E.公司。

1.1.4 試劑的配置

①10%氨水-甲醇溶液：移取10 mL氨水用甲醇定容至100 mL；②0.1%甲酸-水溶液：移取1 mL甲酸用水定容至1 000 mL。

1.1.5 標準溶液的配置

①標準儲備液（1 000 mg/L）：精確稱取10.95 mg春雷霉素鹽酸鹽（折算后含純品春雷霉素10 mg）標準品，用水溶解并定容至10 mL，使其標準儲備液中春雷霉素的質量濃度為1 000 mg/L。置于1～4℃冰箱保存，可保存12個月。②標準中間液（10.00 mg/L）：準確移取各標準儲備液100 μL用水定容至10 mL，混勻。置于1～4℃冰箱保存，可保存1個月。

1.2 試樣的制備與保存

抽取番茄樣品，先用攪拌機攪碎，再用高速分散均質器以15 000 r/min轉速進一步勻漿至糊狀，于4℃保存，待測。

1.3 試樣的前處理

1.3.1 提取

稱取均質后試樣2.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL水，渦旋均勻，超聲15 min，以3 000 r/min轉速離心10 min，用水定容至20 mL。

1.3.2 凈化

取10 mL提取液過用6 mL甲醇、6 mL水活化好的PCX混合陰離子交換固相萃取柱。隨后用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，抽干。用10%氨水-甲醇9 mL洗脫：用甲醇定容至10 mL；取2 mL氮吹去除氨水，至約0.5 mL；用50%甲醇水溶液定容至2 mL，過膜后上機進行LC-MS/MS檢測。

1.4 儀器條件

①液相條件。色譜柱：HILIC柱（150 mm×3.0 mm，5 μm）；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈，流動相梯度見表1；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL。

表1 流動相梯度

②質譜條件。離子源：電噴霧ESI離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：SRM；電噴霧電壓：3 500 V；鞘氣：高純氮氣，5 psi；輔助氣：高純氬氣，5 psi。

2 結果與討論

2.1 儀器條件的確定

春雷霉素在C18液相色譜柱上沒有保留，本方法采用HILIC柱進行色譜分析。采用乙腈和0.1%甲酸水溶液作為流動相。

在全掃描方式下，配置一定濃度標準品，將標準品直接注入質譜來優化質譜條件，找到最強的+H離子峰作為母離子，對選定的母離子進行掃描，優化碰撞能，選擇其中響應和峰型較好的2對離子對作為定量離子（380.2/112.0）和定性離子（380.2/336.1）。碰撞能量（V）為17/5，傳輸透鏡補償電壓為74 V。春雷霉素標準品的多反應監測模式離子掃描譜見圖1。

圖1 春雷霉素的標準品多反應監測模式離子描譜圖

2.2 標準曲線

為消除LC-MS/MS的基質效應對檢測結果造成的影響，筆者以空白番茄提取液作為溶劑配置并繪制春雷霉素標準物質的基質工作曲線，質量濃度點分別為5、10、20、50、100 μg/L，利用MRM離子掃描方法進行檢測，得到春雷霉素標曲線的回歸方程，線相關系數為0.999 7，在5～100 μg/L范圍內呈現良好的線性關系，適合做定量分析。春雷霉素的基質工作曲線見圖2。

圖2 春雷霉素的基質工作曲線

2.3 方法的準確度和精密度

按照已建立的方法，以番茄為空白，按照0.05、0.10、0.20 mg/kg的加標量對春雷霉素進行添加實驗，每個水平進行7次平行試驗，檢驗方法的準確度和精密度。回收率為75.25%～85.74%，相對標準偏差為2.51%～3.80%。各組分的加標回收率和相對標準偏差見表2。春雷霉素樣品加標多反應監測模式離子掃描譜圖見圖3。

2.4 實際樣品的測定

利用所建立的方法分析了從上海某市場及超市中采集的番茄樣品中的春雷霉素，在少數的番茄樣品中檢測到微量春雷霉素殘留，但未達到方法檢出限。圖4是某市場采集的番茄樣品的多反應監測模式正離子掃描譜圖。

表2 春雷霉素的加標量、加標回收率和相對標準偏差

圖3 春雷霉素的樣品加標多反應監測模式正離子掃描譜圖

圖4 實際樣品的多反應監測模式正離子掃描譜圖

3 結 論

本實驗采用水溶液為提取溶劑，將固相萃取-液相色譜-串聯質譜聯用技術相結合，建立了測定番茄中春雷霉素殘留量的分析方法。該方法操作簡單、快速，靈敏度，準確度高，穩定性好，污染小，檢出限能夠滿足相關殘留限值的要求。利用該方法能夠實現番茄中春雷霉素殘留量的檢測。