血管生成素-2上調增強血管瘤干細胞血管形成能力的研究

張明亮 吳杉英 王彪 劉照亮 雷忱

[摘要]目的：探究Ang2上調后對血管瘤干細胞（HemSCs）血管形成能力的影響，揭示Ang-Tie2體系在血管瘤血管發生發展過程中的作用。方法：通過免疫磁珠陽性分選技術分離純化HemSCs，經體外培養擴增，通過慢病毒轉染的方法獲得Ang2上調穩定表達的HemSCs。通過血管形成實驗檢測Ang2上調的HemSCs血管形成能力的變化，通過WesternBlot檢測相關細胞信號通路關鍵靶蛋白表達變化。結果：Ang2上調的HemSCs血管形成能力大于對照組;血管生成信號通路關鍵靶蛋白在HemSCs Ang2上調組中表達增強。結論：Ang2上調可以增強HemSCs的血管形成能力。

[關鍵詞]血管瘤;干細胞;血管生成素2;血管形成;信號通路

[中圖分類號]R732.2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）09-0089-03

Increased Expression of Angiopoietin-2 Enhanced Angiogenesis of Hemangioma Stem Cells

ZHANG Ming-liang，WU Shan-ying，WANG Biao，LIU Zhao-liang，LEI Chen

（Department of Plastic Surgery，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350005，Fujian，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect of Ang2 up-regulation on the Angiogenic capacity in hemangioma stem cells （HemSCs） and to reveal the role of Ang-Tie2 system in the vasculogenesis of hemangiomas. Methods? Separation and purification of HemSCs by positive selected immunomagnetic beads sorting. After being cultured and amplified in vitro， up-regulation of Ang2 by stable lentiviral transfection HemSCs. The vasculogenesis ability of HemSCs cells up-regulated by Ang2 was observed by Angiogenesis Experiment. Detect the expression changes of key protein target in cell signaling pathway by Western Blot Protein. Results? Ang2 up-regulated HemSCs angiogenesis ability was greater than the control group. Key target proteins of angiogenesis signaling pathway was enhanced in HemSCs Ang2 up-regulated. Conclusion? Ang2 up-regulation can enhance HemSCs' angiogenesis ability.

Key words： hemangioma; stem cells; angiopoietin 2（Ang2）; angiogenesis; signaling pathway

嬰幼兒血管瘤（Infantile hemangioma，IH）是一種常見的血管瘤，其獨特的生長周期是在嬰兒期6～8個月內迅速生長，形成大量血流紊亂的血管組織，其后3～7年緩慢自發消退[1]。雖然是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，但目前對嬰幼兒血管瘤中導致血管異常增殖的機制知之甚少。血管系統的發育依賴于調節內皮細胞的增殖、遷移和分化，這兩個過程稱為血管生成和血管新生。在血管成熟的調節劑中，血管生成素具有特別重要的作用[2]。血管生成素（Ang）生長因子和內皮性的Ang/Tie受體調節人體組織中的血管和淋巴管發育、血管通透性、炎癥、血管生成重塑和腫瘤血管形成[3]。

Ang/Tie信號通路由兩種酪氨酸激酶受體（Tie1，Tie2）和人體中已知的三種Tie2配體（Ang1，Ang2，Ang4）組成。Ang2結合內皮特異性Tie2并在血管生成過程中充當Ang1-Tie2信號傳導的負調節因子，從而控制血管對外源細胞因子的反應性[4]。Ang2通過阻斷Ang1的作用使血管不穩定并啟動血管重塑。Ang2介導的血管重塑使血管對其他類型的血管生成因子敏感[5]。本研究通過慢病毒轉染技術使血管瘤干細胞的Ang2表達水平上調，以探究在血管瘤異常血管形成過程中Ang2所起的作用。

1? 材料和方法

1.1 血管瘤干細胞的分離、培養：排除經藥物或激光治療的病例，選取筆者醫院增殖期嬰幼兒血管瘤手術標本1例。通過患者及其家屬知情同意，且本研究已通過福建醫科大學附屬第一醫院醫學倫理委員會審核批準倫理審批文書批號：閩醫大附一倫理醫技審[067]號。將血管瘤組織用PBS清洗去除表面血凝塊，用小剪刀剪成1mm3大小的組織塊，加入0.2%膠原酶37℃水浴箱消化2h。以孔徑為70μm的無菌濾膜過濾，獲得單細胞懸液。每1×107個細胞加入20μl CD133免疫磁珠，充分混合后。將細胞懸液加入分選柱中，收集磁珠結合的CD133+細胞;以5×105個細胞/孔接種于500ng/ml的纖維連接蛋白包被的6孔培養板，置37℃、5%CO2培養箱內。24h后傳代接種。

1.2 慢病毒轉染及細胞分組：根據細胞MOI及病毒滴度，干預組加入相應病毒量（Ang2上調），陰性對照組以相同條件加入無義慢病毒（Ang2-254），空白對照組以相同條件加入等體積PBS;轉染成功后每孔加嘌呤霉素0.2mg/ml篩選穩轉株，穩轉株以篩選濃度的一半濃度的嘌呤霉素維持培養。

1.3 血管形成實驗：將圓形比例蓋玻片置于12孔板中，將Matrigel按200μl/孔均勻包被蓋玻片，置于培養箱孵育30min，待凝膠成固體。將三組血管瘤干細胞（HemSCs）分別以1×105個/孔接種，加培養基培養，每8h觀察拍照，Image J軟件計算不同組中分支點及毛細管長度。

1.4 蛋白濃度測定：提取不同組細胞中的蛋白，BCA測定蛋白濃度。把蛋白樣品（20μg）上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內，轉PVDF膜60min。2%的BSA室溫下孵育2h，一抗4℃孵育過夜，室溫孵育二抗2h，掃描成像，并分析條帶灰度值。

1.5 統計學分析：應用SPSS 23.0軟件通過Student t檢驗或方差分析（ANOVA）進行數據統計分析，并進行后期Tukey檢驗。所有值以x?±s表示。以P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 HemSCs原代分離培養結果：經免疫磁珠分選后，所得細胞形態均一，細胞純度較高。接種4h后，即貼壁生長，細胞呈長梭形，見圖1。

2.2 HemSCs Ang2上調慢病毒轉染結果：Ang2上調慢病毒轉染：在MOI 30時細胞轉染效率達90%，達最佳轉染效果;Ang2上調慢病毒顆粒可穩定轉染HemSCs，且傳代后Ang2上調轉染特性不變。轉染后HemSCs細胞形態如圖2所示，呈長梭形，與HemSCs相比無明顯差別。

2.3 血管生成實驗結果：與血管瘤血管形成密切相關，可以反映毛細血管的官腔形成的早期過程。取不同實驗組中的HemSCs進行血管形成實驗，結果如圖3所示，干預（HemSCs Ang2上調）組血管形成的節點數及毛細管長度均顯著高于其余兩組。

2.4 Western Blot分析結果：為驗證Ang2上調后HemSCs成管能力改變的可能信號通路，檢測了影響血管生成的相關蛋白，結果如圖4～5所示：Ang2、VEGF、ERK1在Ang2上調組中表達量均顯著上調。

3? 討論

大部分的嬰幼兒血管瘤可自發向消退期轉歸，并不需要治療，但在這個過程中約有10%～15%的患者會出現因為腫瘤的快速生長帶來的并發癥，如：出血、潰瘍、外觀損毀、充血性心力衰竭、永久性視力損害、氣道梗阻等[6]，有時甚至危及生命。此時，為控制相關并發癥通常需要對腫瘤生長進行干預。

近年來，嬰幼兒血管瘤的治療發生了顛覆性地變化。傳統一線藥物糖皮質激素，已經迅速被口服普萘洛爾的新方法代替。相比于激素治療，普萘洛爾具有迅速有效、耐受良好和安全性高的特點。然而普萘洛爾抗嬰幼兒血管瘤的作用機制尚無定論。雖然其安全性高，但療程較長。依據最新的推薦，口服普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤的持續用藥時間應大于6個月。即便如此，也仍有10%～15%的復發率[7]。本研究以嬰幼兒血管瘤病理過程為線索，探索潛在的治療靶點及其理論依據。

Ang-Tie2系統是血管生成和血管完整性的重要調節劑[8]。Tie2的激活狀態是由Ang1和Ang2之間的相對平衡決定的，Ang2是體內Ang1的天然拮抗劑，但Ang2本身的確切功能尚不清楚。有學者認為高濃度的Ang2可以通過結合Ti2受體，并通過MAPK-ERK途徑，在內皮細胞中發揮其抗凋亡作用[9]。本研究證實，Ang2在干預（HemSCs Ang2上調）組中表達量顯著增加（見圖4～5），且細胞有更強的成管能力（見圖3）。

為了驗證這種成管能力的改變在HemSCs中是否通過MAPK-ERK信號通路途徑，檢測了HemSCs中MAPK-ERK通路關鍵靶蛋白ERK1。ERK1可以通過磷酸化多種酶、激酶和轉錄因子等下游因子，進而調節細胞的功能。這些作用可激活蛋白的翻譯，增強細胞的生長。在本研究中干預（HemSCs Ang2上調）組ERK1表達量皆高于其余兩組（見圖5），這也就從一方面解釋了HemSCs Ang2上調組中成管能力增強的現象。

綜上所述，本研究證明了Ang2上調可以通過增加VEGF、ERK1、Ang2等血管生成調控蛋白的表達從而增強HemSCs的血管生成的能力，Ang-Tie2體系在血管瘤血管形成過程中起一定作用。然而各種調控蛋白之間的相互作用以及血管瘤異常血管生成的原因還需要進一步的實驗研究。

[參考文獻]

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[7]Mong EF，Akat KM，Canfield J，et al.Modulation of LIN28B/Let-7 signaling by propranolol contributes to infantile hemangioma involution[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2018，38（6）：1321-1332.

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[9]Viallard C，Larrivée B.Tumor angiogenesis and vascular normalization： alternative therapeutic targets[J].Angiogenesis，2017，

20（4）：409-426.

[收稿日期]2019-12-25

本文引用格式：張明亮，吳杉英，王彪，等.血管生成素-2上調增強血管瘤干細胞血管形成能力的研究[J].中國美容醫學，2020，29（9）：89-91.