豬飼料、豬尿、豬肉中β 受體激動(dòng)劑常見(jiàn)檢測(cè)方法

宋 瑞，楊 潔，蘇 霞，趙 博，林文秀

（1.石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心 050000；2.石家莊市農(nóng)業(yè)行政綜合執(zhí)法支隊(duì) 050000）

β 受體激動(dòng)劑是最常見(jiàn)的一類(lèi)瘦肉精。 初始被用于治療哮喘患者，后期因副作用大而被棄用。80 年代有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)蛋白質(zhì)合成提高豬瘦肉比率，應(yīng)用廣泛，但是隨著人們對(duì)食品安全認(rèn)識(shí)的提高， 發(fā)現(xiàn)β 受體激動(dòng)劑很容易在豬內(nèi)臟器官里蓄積殘留。人們過(guò)量食用此類(lèi)肉品，會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀。因此，對(duì)β 受體激動(dòng)劑進(jìn)行嚴(yán)把關(guān)，深檢測(cè)尤為重要。

1 豬飼料中β 受體激動(dòng)劑檢測(cè)方法

2008 年黃士新、沈富林、曹瑩等專(zhuān)家對(duì)飼料中β 受體激動(dòng)劑的檢測(cè)提出了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。 該方法的原理是將飼料磨碎后， 使用提取液位鹽酸甲醇混合溶液， 使用乙酸鉛沉淀蛋白，通過(guò)固相萃取小柱凈化，凈化后收集的液體旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干，使用0.2%甲酸水溶液溶解，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量。具體實(shí)驗(yàn)方法是于50mL 離心管中稱(chēng)取2g 飼料試樣，加入19mL 鹽酸甲醇提取液和1mL 飽和醋酸鉛溶液， 渦旋混合均勻，充分振蕩20min，然后于7000r/min 離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。選用混合型陽(yáng)離子交換柱，依次用3mL 甲醇和3mL 水活化， 取轉(zhuǎn)移出的上清液5mL 過(guò)柱， 而后依次使用2mL 水、2mL 甲醇淋洗，帶全部淋洗液流出，抽干2min，用5%氨水甲醇溶液5mL 洗脫，收集洗脫液并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至干，用1mL 0.2%甲酸水溶液溶解，0.22μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。 該方法在0.05 mg/kg 至1mg/kg 濃度范圍內(nèi)的添加回收率為80%土20%。

2 豬尿中β 受體激動(dòng)劑檢測(cè)方法

飼喂β 受體激動(dòng)劑的豬只，在屠宰前，通常采用檢測(cè)豬尿中β 受體激動(dòng)劑的方式，來(lái)觀測(cè)豬只體內(nèi)是否含β 受體激動(dòng)劑。針對(duì)豬尿中β 受體激動(dòng)劑的檢測(cè)王樹(shù)槐、孫雷、劉琪、汪霞4 位專(zhuān)家研究出了非常科學(xué)的檢測(cè)方法， 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬尿中β 受體激動(dòng)劑。 該方法的主要原理是通過(guò)兩種酶酶解豬尿試樣中的β 受體激動(dòng)劑殘留物，使其發(fā)生反應(yīng)形成絡(luò)合物，離心，取上清液，通過(guò)調(diào)節(jié)pH 值沉淀蛋白，增加β 受體激動(dòng)劑的溶解性，使用異丙醇乙酸乙酯混合溶液進(jìn)行徹底提取， 使用固相萃取柱進(jìn)行凈化，濃縮后過(guò)濾膜用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。具體實(shí)驗(yàn)方法為：混合均勻試樣，在50mL 離心管內(nèi)移取5mL 尿樣， 加入0.5mL 2mol/L 的乙酸銨緩沖液(于100mL 容量瓶中稱(chēng)取15.4g 乙酸銨，加水溶解至刻度，轉(zhuǎn)移至廣口瓶中，用乙酸調(diào)pH 至5.2)，再加入40μL 鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，兩種酶缺一不可，渦旋混勻，于37℃下避光水浴振蕩16h。 酶解后，配制內(nèi)標(biāo)物濃度為100ng/mL，而后在待測(cè)樣品中添加100μL，渦旋混勻，使用高速離心機(jī)10000r/min 高速離心10min，另置50mL 離心管，轉(zhuǎn)移上層清液至其中，配制5mol/L的NaOH 溶液，后調(diào)節(jié)pH 至9.8，加入10mL 異丙醇乙酸乙酯混合溶液(比例為異丙醇：乙酸乙酯=6：4)，再加入2g 固體氯化鈉飽和水相，渦旋混勻，振搖10min， 使用高速離心機(jī)10000r/min 離心10min， 將上清液倒入50mL 旋蒸瓶?jī)?nèi)， 使用10mL 異丙醇乙酸乙酯混合溶液(比例為異丙醇：乙酸乙酯=6∶4)重復(fù)提取一次，使用高速離心機(jī)10000r/min 離心10min，上清液倒入上述50mL 旋蒸瓶?jī)?nèi)，50℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，用5mL2mol/L 的乙酸銨溶液(pH=5.2)溶解。 使用MCX 柱為固相萃取柱，依次用3mL 甲醇、3mL 水活化，而后將上述溶解液全部過(guò)柱，依次用3mL 水、3mL2%的甲酸水溶液、3mL 甲醇淋洗，待淋洗液全部過(guò)柱后，空氣抽干，用5mL5%的氨水甲醇溶液洗脫； 洗脫液在50℃下吹干。 吹干后的殘余物用1mL 甲醇0.1%甲酸/水(甲醇：0.1%甲酸/水=5 ∶95)溶解，過(guò)濾膜后供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。 該方法的檢測(cè)限為0.3ng/mL、定量限為0.5ng/mL。 在0.5ng/mL 至2ng/mL 添加濃度的回收率為60%至120%。 該方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜20%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜20%。

3 豬肉中β 受體激動(dòng)劑檢測(cè)方法

對(duì)于動(dòng)物源性食品中β 受體激動(dòng)劑檢測(cè)方法。 王樹(shù)槐、孫雷、朱永林、張?bào)P、汪霞5 位專(zhuān)家提出了科學(xué)合理的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中β 受體激動(dòng)劑。 該方法的原理是先酶解豬肉試料中的β 受體激動(dòng)劑殘留物，使用高氯酸調(diào)pH 后沉淀蛋白，經(jīng)高速離心，移取上清液，調(diào)節(jié)pH 值，分別使用乙酸乙酯和叔丁基甲醇提取，使用固相萃取柱凈化，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。 具體試驗(yàn)方法是：準(zhǔn)確稱(chēng)取2g 豬肉樣品于50mL離心管內(nèi)，加入8.0mL 0.2moL/L 乙酸銨溶液(稱(chēng)取15.4g 乙酸銨，將其溶解于1000mL 水中，用適量乙酸調(diào)pH 至5.2)，再加入鹽酸葡萄糖醛昔酶/芳基硫酸酯酶40μL，渦旋混勻，于37℃下避光水浴振蕩16h。 酶解完成后，拿出離心管放置至室溫，渦旋混勻，使用高速離心機(jī)10000r/min 高速離心10min， 另備50mL 離心管，將上清液傾到于此，而后加入5mL 0.1moL/L 高氯酸溶液，渦旋混勻，用高氯酸調(diào)pH 至1.0，使用高速離心機(jī)10000r/min 離心10min 后， 移取上清液轉(zhuǎn)移至另備50mL 離心管內(nèi)。 用10moL/LNaOH 溶液調(diào)pH 至9.5，加入乙酸乙酯15mL，渦旋混勻，振蕩10min，5000r/min 離心5min， 取出上層有機(jī)相至另一50mL 離心管內(nèi)。 再在下層水相中加入叔丁基甲醍10mL，渦旋混勻，并振蕩10min，10000r/min 離心5min， 合并有機(jī)相，50℃下氮?dú)獯蹈桑?%甲酸溶液5mL 溶解，備用。 使用MCX 固相萃取柱為凈化柱依次用3mL 甲醇、3mL 水、3mL2%甲酸溶液活化， 取上述備用液全部過(guò)柱，再依次用3mL2%甲酸溶液、3mL 甲醇淋洗，待淋洗液全部流出，空氣抽干，使用2.5mL 3%氨水甲醇溶液洗脫，將洗脫液在50℃下用氮?dú)獯蹈伞?殘余物用甲醇0.1%甲酸溶液(甲醇0.1%甲酸溶液=10 +：90，V/V)1mL 溶解，渦旋混勻，15000r/min 高速離心10min，取上清液適量，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。 該方法檢測(cè)限為0.25μg/kg， 定量限為0.5μg/kg。 本方法在0.5μg/kg 至2μg/kg 添加濃度范圍內(nèi)，用空白添加標(biāo)準(zhǔn)校正，其回收率范圍為70%至120%。 本方法批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%。

4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀儀器操作條件

以上豬飼料、豬尿、豬肉中β 受體激動(dòng)劑檢測(cè)方法，由于樣品不同，前處理操作各不相同，但是均為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，使用的儀器設(shè)備相同，因此儀器的使用條件相同。 以下為我單位使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀儀器條件：儀器型號(hào)為AB Sciex 5500；流動(dòng)相為A 相：0.1%甲酸水，B 相：0.1%甲酸乙腈；色譜柱為Agilent Eclipse C18 柱，規(guī)格：100mm×2.1mm，粒徑3.5μm；柱溫為30℃；流速為0.3mL/min；進(jìn)樣量為10μL。

表1 流動(dòng)相梯度設(shè)置

電噴霧離子源（ESI）正離子掃描；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；脫溶劑氣為高純氮?dú)?氣流量：1000L/h)；錐孔氣為高純氮?dú)?氣流量：150L/hr)；碰撞氣為氬氣。

以上為β 受體激動(dòng)劑在飼料、豬尿、豬肉中的檢測(cè)方法及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀儀器設(shè)定條件，檢測(cè)飼料、豬尿、豬肉β 受體激動(dòng)劑是一項(xiàng)艱巨的工作任務(wù)， 我們檢測(cè)工作者只有科學(xué)合理進(jìn)行檢測(cè)工作，方能夠確保老百姓飲食安全。

表2 9 種β-受體激動(dòng)劑的定性、定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞能量