丹參酮ⅡA預防大鼠椎板切除術后硬膜外疤痕增生的機制分析

史宗坡 王剛 王彬彬 賈根 劉軍

丹參酮ⅡA是丹參的有效成分,其作為一種心血管藥物,廣泛應用于臨床[1]。此外有研究證明,丹參酮ⅡA可誘導疤痕組織中成纖維細胞凋亡,從而達到抑制其增生的作用,但具體機制尚未闡明[2]。本次研究旨在比較不同濃度丹參酮ⅡA干預對SD大鼠椎板切除術后硬膜外疤痕增生的效果,以期為今后丹參酮ⅡA應用于臨床奠定理論依據,現(xiàn)將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 實驗動物及分組 選取北京大學醫(yī)學院實驗動物中心提供的雄性成年Sprague-Dawley大鼠24只,清潔級,體質量250～300 g,自然光照下常規(guī)飼養(yǎng),室溫保持在23 ℃左右。根據隨機數字表將其分為Ⅰ～Ⅳ組，每組各6只。實驗大鼠均健康,Ⅰ組平均體質量為(232.7±7.6)g,Ⅱ組平均體質量為(233.5±7.7)g,Ⅲ組平均體質量為(233.0±7.5)g,Ⅳ組平均體質量為(231.9±7.4)g,組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 實驗儀器及試劑 (1)Attune NxT流式細胞儀(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司);(2)Eppendorf 5427 R臺式高速冷凍離心機(艾本德中國有限公司);(3)奧林巴斯CX23顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社);(4)電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);(5)10%水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司);(6)二甲基亞砜(南京東德化工有限公司);(7)免疫組織化學SP試劑盒(美國Sigma公司);(8)p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白檢測試劑盒(北京泰澤瑞達科技有限公司);(9)小動物高場磁共振成像儀,型號:Biospec 7T/20 USR(德國Bruker公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 L1椎板切除SD大鼠模型制備:大鼠均以10% 水合氯醛(2.5～3.0 mL/kg)腹腔注射麻醉,俯臥位固定。背部脫毛備皮,取鼠脊柱正中切口長約2 cm,顯露L1和L2椎板,切除全L1椎板,顯露硬脊膜,壓迫止血。

1.3.2 丹參酮ⅡA干預動物模型的建立:將丹參酮ⅡA溶解于二甲基亞砜,Ⅰ組按100 mg/kg劑量制成10 mL溶液給予腹腔注射;Ⅱ組按200 mg/kg劑量制成10 mL溶液給予腹腔注射;Ⅲ組按300 mg/kg劑量制成10 mL溶液給予腹腔注射。Ⅳ組腹腔注射10 mL生理鹽水。

1.3.3 瘢痕面積測量:干預后1個月，每組隨機選取3個標本進行MRI掃描(磁場強度:7T,高分辨像,橫切面圖像,序列:15層,層厚0.8 mm,層間距1.3 mm),應用REGION OF INTEREST TOOL對所選MRI圖像硬脊膜后方感興趣區(qū)進行測定并計算瘢痕面積。

1.3.4 成纖維細胞凋亡率和細胞周期G0/G1期比例計算:于干預后24 h、72 h和120 h時精確切取各組大鼠約0.5 g疤痕組織,分別制備細胞懸液,根據Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測專用試劑盒的說明書進行操作,利用流式細胞儀檢測疤痕組織中成纖維細胞凋亡率。將上述時間點制備的細胞懸液接種于培養(yǎng)皿,經乙醇固定、PBS洗滌、孵育、染色后用300目篩網過濾,調整細胞濃度至109/mL,由流式細胞儀檢測,計算細胞周期G0/G1比例。

1.3.5 檢測p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達水平:干預后120 h取大鼠疤痕組織,制備成纖維細胞懸液,于4 ℃下裂解20 min,提取總蛋白,測定蛋白濃度并定量。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移至聚偏氟乙烯膜,室溫下用脫脂奶粉封閉2 h,加入1∶500稀釋的一抗后室溫孵育過夜,三乙醇胺緩沖鹽溶液(TBS)洗滌2次,加入1∶500稀釋的二抗,室溫孵育2 h,TBS洗滌2次。通過增強化學發(fā)光法顯影檢測,以p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3與內參β-actin蛋白的積分光密度(IOD)比值作為上述蛋白的相對表達量[3]。

2 結果

2.1 各組大鼠瘢痕面積比較 術后所有大鼠傷口愈合良好。干預后1個月，4組瘢痕面積差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),由大到小依次為Ⅳ組、Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組[(2.56±0.12)mm2,(1.92±0.10)mm2,(1.77±0.12)mm2,(1.51±0.09)mm2]。

2.2 各組大鼠成纖維細胞凋亡率和細胞周期G0/G1期比例比較 4組干預后24 h、72 h及120 h,不同時間點的成纖維細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(F=22.663,P<0.001);4組間成纖維細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(F=25.223,P<0.001),其中Ⅲ組成纖維細胞凋亡率較高;4組的成纖維細胞凋亡率變化趨勢差異有統(tǒng)計學意義(F=18.004,P<0.001)。4組不同時間點的G0/G1期比例差異有統(tǒng)計學意義(F=14.884,P<0.001),4組間比較,差異也有統(tǒng)計學意義(F=23.661,P<0.001),其中Ⅲ組G0/G1期比例較高;4組的G0/G1期比例變化趨勢差異有統(tǒng)計學意義(F=18.337,P<0.001)。見表2。

表2 各組大鼠成纖維細胞凋亡率和細胞周期G0/G1期比例比較

2.3 各組大鼠瘢痕組織p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達水平比較 干預后120 h 4組瘢痕組織中p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),p53、Caspase-3和Bax表達水平由高到低依次為Ⅲ組、Ⅱ組、Ⅰ組和Ⅳ組,survivin和Bcl-2表達水平由高到低依次為Ⅳ組、Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組。見表3。

表3 各組大鼠瘢痕組織p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達水平比較

3 討論

椎板切除術是脊柱外科中最常用的椎管減壓手術術式之一,但術后椎板切除區(qū)域常出現(xiàn)成纖維細胞大量增殖和細胞外基質代謝異常,導致硬膜外瘢痕粘連,并牽拉鄰近區(qū)域硬膜和神經根,引起一系列相應癥狀,嚴重影響手術療效,這也正是下腰椎術后失敗綜合征發(fā)生的主要原因[4]。盡管硬膜外瘢痕粘連可以通過二期手術得以松解,但粘連常在術后2～4周后再次發(fā)生,甚至會產生更多瘢痕,需要再次手術，使醫(yī)源性神經根損傷和硬膜撕裂的危險大大增加[5]。因此,預防或減少椎板切除術后硬膜外瘢痕形成,一直是骨科領域備受重視的課題,其對提高椎板切除術療效具有重要意義[6]。中醫(yī)藥在治療增生性瘢痕方面歷史悠久,隨著中藥有效成分提煉技術的不斷改進,其療效不斷增加[7-8]。丹參酮ⅡA是由丹參根部提取的有效脂溶性成分之一。研究發(fā)現(xiàn)參酮ⅡA具有誘導疤痕組織中成纖維細胞凋亡、抑制其增生的作用,而椎板切除術后硬膜外瘢痕主要是由于硬膜后方的成纖維細胞增殖而形成的[9-10]。若丹參酮ⅡA可以有效地誘導SD大鼠椎板切除術后瘢痕組織中成纖維細胞的凋亡,將為抑制硬膜外瘢痕組織增生提供一種新的給藥選擇[11-12]。

從本次研究的結果來看,術后所有大鼠傷口愈合良好,干預后1個月，4組瘢痕面積差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),由大到小依次為Ⅳ組、Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組,一方面證實丹參酮ⅡA具有抑制疤痕增生的作用,另一方面這種抑制作用隨丹參酮ⅡA濃度的增加而提高。4組干預后24 h、72 h及120 h的成纖維細胞凋亡率和G0/G1期比例比較,差異均有統(tǒng)計學差異(P<0.05),其中Ⅲ組成纖維細胞凋亡率和G0/G1期比例較高,4組成纖維細胞凋亡率和G0/G1期比例差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與陳剛等[13]研究結果一致,提示丹參酮ⅡA抑制疤痕增生是通過誘導成纖維細胞凋亡和阻滯細胞周期完成的。p53為經典抑癌基因,Caspase-3是Caspase家族的促凋亡蛋白,Bcl-2和Bax分別為Bcl-2家族的抑凋亡和促凋亡蛋白,而survivin是凋亡抑制蛋白家族中的成員,上述5種細胞因子均在細胞增生和凋亡的平衡中發(fā)揮重要作用[14]。本研究顯示,干預后120 h,4組瘢痕組織中p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明丹參酮ⅡA發(fā)揮抑制成纖維細胞增殖,誘導凋亡的作用可能與上調p53、Caspase-3和Bax蛋白表達,下調survivin和Bcl-2蛋白表達有關。本次研究的主要不足在于動物實驗的局限性,動物與人體組織結構尚存在一定差距,丹參酮ⅡA應用于人體是否仍然有效有待進一步探究。同時,丹參酮ⅡA的最佳給藥劑量、對其他組織細胞有無毒性作用仍是需解決的關鍵科學問題。

綜上所述,丹參酮ⅡA具有抑制成纖維細胞增殖、誘導凋亡的作用,其效果存在濃度依賴性,機制可能與多種細胞因子的調節(jié)有關。