基質金屬蛋白酶2/9在慢性肝臟疾病發生發展中的作用

楊尚青， 楊東亮， 劉 嘉

華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院 感染性疾病科， 武漢 430022

慢性肝臟疾病(chronic liver diseases, CLD)作為全球高發病率和病死率的主要誘因之一，嚴重危害全人類的健康。HBV和HCV可在全球數億人中導致慢性感染。各種原因(病毒性、酒精性和代謝性等)造成的慢性肝炎反復遷延，導致肝纖維化，并進展為肝硬化及肝細胞癌(HCC)[1]。CLD發展過程中的一個重要組織學變化是細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的降解和重塑，這是病理和生理交織的復雜過程。一方面，ECM在肝臟中過度地累積參與肝纖維化和HCC進程；另一方面，HCC形成后，ECM的降解可促進癌細胞的轉移和侵襲[2-3]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)超家族成員在ECM的重塑和降解過程中發揮重要調控作用，MMP的表達和活性失調導致的ECM變化是影響多種CLD進展的重要因素[4]。新近研究表明，MMP-2/MMP-9可通過降解多種類型的底物而發揮重要的免疫調節作用，且其表達和活性也受多種炎癥及免疫分子信號通路的調控。因此，全面認識MMP-2/MMP-9在CLD發生發展中的作用機制，對于尋找新的治療策略具有重要意義。

1 MMP家族概述

20世紀60年代， Gross和Lapiere[5]在研究蝌蚪變青蛙過程的膠原重塑作用時發現間質膠原酶，即最初的MMP-1。隨后，眾多研究發現極大地拓展了對于MMP結構和功能的認識。迄今為止，已發現的人類MMP家族包含24個結構和功能相關的成員，根據其結構和底物特異性分為6個亞族：膠原酶、明膠酶、間質溶解素、基質溶解素、膜型MMP(membrane-type MMP, MT-MMP)和其他酶類[6](表1)。大多數MMP為組成型表達，且在維持體內穩態時發揮重要作用，如MMP-2；某些MMP僅在特定條件下由特定的細胞或組織表達，如需要炎癥信號誘導表達的MMP-9，僅在巨噬細胞和肺上皮細胞表達的MMP-12，僅在牙釉質組織表達的MMP-20[7-9]。

MMP既能降解膠原、纖連蛋白、蛋白聚糖等ECM，也可作用于非ECM底物，如細胞因子、趨化因子等，在炎癥和免疫應答中發揮調控功能[10]。 MMP具有很高的酶解活性，對細胞微環境存在潛在的災難性影響，所以通常情況下，其表達量極低且作為無活性的酶原存在于微環境中。此外，MMP的定位和活性還受到多種細胞因子(如IL、生長因素、TNFα等)的嚴格調控[11]。在類風濕性關節炎、神經性炎癥以及多種癌癥中，MMP活性的失調會造成組織穩態的嚴重失衡[12]。因此，MMP可在胚胎發育、細胞遷移、血管生成、損傷修復、免疫應答、炎癥進程中發揮重要功能。

2 MMP-2/MMP-9

明膠酶，也稱為Ⅳ型膠原酶，包括MMP-2(即明膠酶-A，72 kD)和MMP-9(即明膠酶-B，92 kD)兩種，是循環中主要的MMP，能夠高效降解膠原分子的退化產物明膠。MMP-2/MMP-9的結構中包含信號肽區域，能夠有效介導肽鏈的定位；其催化結構域中含有3個連續Ⅱ型纖連蛋白樣重復序列，極大地提高對明膠的親和力[13]。除明膠之外，MMP-2/MMP-9還可降解ECM中的其他分子，如彈性蛋白、纖連蛋白和某些趨化因子等。由于MMP-2/MMP-9的生理學功能不盡相同，因此表達兩種酶的細胞類型也有所差異。MMP-2可由許多類型的細胞表達，包括成纖維細胞、內皮細胞、軟骨細胞和巨噬細胞等，MMP-9則由肺泡巨噬細胞、多形核白細胞、破骨細胞和滋養細胞產生[14-15]。

2.1 MMP-2/MMP-9表達的調控 MMP-2/MMP-9的表達受物理、化學、生物等多方面的影響。正常生理情況下，肝臟中的肝細胞、肝星狀細胞等均可產生MMP-2/MMP-9，但表達水平低。在肝纖維化進程中，由于多種信號通路的異常活化，如TGF/Smad和PI3K/Akt，可致使MMP-2/MMP-9的表達水平上調[16]。隨著纖維化程度的加重，肝內細胞往往呈現缺氧狀態，缺氧又可導致MMP-2的表達上調[17]。此外，MMP-2/MMP-9的表達也受細胞因子和趨化因子的調控，如IL-1β、TNFα誘導MMP-2表達上調，而IL-4、IL-10、IFNβ則下調MMP-9的表達[18]。

表1 人類MMP家族的分類及其底物

2.2 MMP-2/MMP-9活性的調控 分泌型蛋白可通過信號肽和囊泡分泌至細胞外，發揮相應功能。在癌癥細胞中，MMP-2/MMP-9通過定位于VAMP-4和Rab-40b相關的分泌囊泡，防止錯誤靶向溶酶體并驅動MMP遷移至侵襲性偽足[19]。在星膠質細胞中，MMP-2/MMP-9也存在于不同類型囊泡中。因此，細胞區室化是影響MMP-2/MMP-9活性的因素之一。

由于MMP-2/MMP-9的酶解特性，其mRNA翻譯后以無活性酶原形式(pro-MMP)分泌到細胞外間隙。當酶原的前肽結構域中保守半胱氨酸殘基被剪切后，催化位點曝露，酶原被激活為具有生物活性的內切酶。此過程中，MMP-2/MMP-9的分子量降低，活化的MMP-2變為64 kD，活化的MMP-9變為82 kD。根據組織類型和病理進程不同，MMP活化過程可由絲氨酸蛋白纖溶酶及某些MMP介導，也可由MMP胞內激活子弗林蛋白酶、去整合素和金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease，ADAM)、ADAM-TS介導[20]。在腎間質纖維化過程中，纖溶酶在調控MMP活化過程中具有重要作用[20]；在肺癌細胞中，ADAM15通過活化MEK-ERK信號途徑，上調MMP-9的表達和活性[21]。

MMP-2/MMP-9的酶原也可通過形成復雜膜復合物來調控激活。其中，pro-MMP-2和pro-MMP-9體內激活機制不完全相同(圖1)。MMP-2活化過程中，MT1-MMP和基質金屬蛋白酶抑制劑-2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2, TIMP-2)先將胞外環境中的pro-MMP-2招募至細胞膜，從而形成pro-MMP-2/TIMP-2/MT1-MMP膜復合物，之后pro-MMP-2以此膜復合物形式被活化為MMP-2。Toth等[22]發現MT1-MMP和TIMP-2在促使pro-MMP-9活化為MMP-9時作用相似。此外，MMP-2、MMP-13也可促進pro-MMP-9活化形成MMP-9[23]。

MMP活性也受內源性抑制劑(如α2-巨球蛋白)、TIMP、具有TIMP樣結構域的小分子、膜結合抑制劑等調控。目前研究最多的MMP活性抑制劑為TIMP，包括TIMP-1～TIMP-4 4種，可通過1∶1劑量可逆的抑制MMP活性。TIMP-1和TIMP-2對明膠酶的親和力高，可分別優先結合于MMP-9和MMP-2，從而抑制其活性。TIMP對MMP的活化具有雙重性質的影響，即TIMP既可抑制MMP的活化，亦可促進MMP的活化。如一方面TIMP-2可抑制MMP-2的活性；另一方面低濃度TIMP-2亦是MMP-2活化過程中的必需分子[20]。

3 MMP-2/MMP-9參與肝臟疾病的進程

3.1 肝臟的ECM 肝臟ECM主要分布于肝包膜、中央靜脈和竇周隙的皮下空間。肝臟主要膠原蛋白為Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原，中央靜脈區域主要為Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原，基底膜可高度檢測到Ⅳ型膠原[4]。此外，纖連蛋白和層粘連蛋白也是肝臟ECM主要組分，參與維持細胞的分化和代謝。

肝臟ECM代謝是ECM合成和MMP介導的ECM水解的動態變化過程。健康肝臟ECM代謝處于穩定平衡狀態，當肝臟發生病理變化時，自穩狀態被打破，導致疾病進程。此過程中，MMP及TIMP表達的改變有助于調節此種病理狀態的發展。除了重塑ECM外， MMP還具有重要的生物免疫功能。MMP-2通過調節TGFβ激活過程，影響肝內血管穩態；抑制MMP-9可增強血管內皮生長因子-sdf1信號轉導，保護肝臟免受缺血再灌注損傷[4]。因此，MMP-2/MMP-9在維持肝臟穩態中具有重要作用，了解其在CLD進展中的意義，有助于探索針對MMP的治療策略。

3.2 MMP-2/MMP-9與肝纖維化 CLD發病機制涉及肝細胞的反復損傷，造成炎癥、壞死、纖維化并最終導致肝硬化，其中纖維化是CLD發展的主要決定因素。在肝細胞再生期間，持續存在的炎癥因子使ECM轉變為活性狀態，導致Ⅰ、Ⅲ型膠原過度累積，最終產生纖維化[24]。研究[25]表明，HCV感染者肝內MMP-2/MMP-9過度表達，且和患者肝纖維化程度相關；當患者肝纖維化程度加劇時，MMP-9表達呈上調趨勢。在膽總管結扎誘導纖維化的大鼠模型中，MMP-2/MMP-9活性增加，并在結扎第10天達到峰值后維持高水平，此現象表明膽汁淤積引起的炎癥可持續增強MMP-2/MMP-9功能[26]。Zhou等[27]研究發現，切除肝組織15～30 min后，MMP-2/MMP-9表達明顯增加，且迅速達到峰值。因此，MMP-2/MMP-9表達改變是肝組織內炎性細胞因子應答的早期信號。

MMP降解微環境中ECM是肝組織修復和重塑的重要特征，因此MMP-2/MMP-9表達上調亦有助于減弱肝纖維化程度。在四氯化碳(CCl4)和膽總管結扎誘導纖維化的小鼠模型中，MMP-2-/-小鼠纖維化程度明顯高于對照小鼠，提示MMP-2具有抗纖維化作用[28]。Wang等[29]在納米顆粒治療大鼠肝纖維化過程中，觀察到肝內MMP-2表達上調。此外，CCl4誘導纖維化小鼠的MMP-9表達上調，過繼轉移微囊化的人間質干細胞后，小鼠肝纖維化程度減弱，且伴隨MMP-9表達的進一步上調，此現象表明MMP-9表達上調可改善肝臟纖維化[30]。過繼轉移MMP-9-/-小鼠的Kupffer細胞能顯著加劇小鼠肝纖維化程度[31]。

在肝纖維化進展過程中，MMP表達改變伴隨TIMP的變化以維持體內穩態。受損的肝臟可同時呈現MMP活性和TIMP濃度上調；CCl4誘導TIMP-1轉基因小鼠的肝組織纖維化程度顯著高于野生對照組[26]。因此，MMP和TIMP是肝纖維化過程中的重要調控因素。為了全面分析MMP-2/MMP-9在肝纖維化中的作用，也必須明確TIMP-1和TIMP-2的變化。在肝纖維化患者中，MMP-2/TIMP-1比率反映肝細胞損傷程度[26]。調節MMP/TIMP平衡對病理性ECMP轉為生理性ECM至關重要。此外，HCV感染者血清學和組織學結果顯示，MMP-2和TIMP-1可作為預測肝纖維化的非侵入型參數：丙型肝炎肝硬化患者MMP-2活性上調，且TIMP-1表達在肝炎、肝纖維化和肝硬化患者中持續增加[32]。因此，定期監測肝炎患者MMP-2/MMP-9水平可作為預測肝纖維化進程的指標。

3.3 MMP-2/MMP-9與HCC HCC是肝臟中最常見的原發惡性腫瘤，隨著發病率的增加，它已成為全球腫瘤相關死亡的第二大主要原因，每年導致80多萬人死亡[33]。ECM與細胞間相互作用，影響癌細胞增殖、遷移、凋亡等方面。早期癌細胞表達MMP有助于ECM重塑并釋放膜結合生長因子，提供腫瘤發生的微環境；隨后MMP-2/MMP-9通過降解由基底膜、間質結締組織和各種蛋白組成的ECM，調控腫瘤的進程和轉移；最后MMP還影響癌細胞的存活以及凋亡[14]。因此，MMP-2/MMP-9在肝癌細胞轉移、侵襲、血管生成和凋亡等進程中發揮重要調控作用(表2)。

ECM是阻礙肝癌細胞轉移的重要屏障，無法控制肝癌細胞轉移是HCC患者死亡的主要原因之一。MMP-2/MMP-9可降解ECM，破壞細胞外物理屏障，促進肝癌細胞轉移及侵襲。其主要過程為：首先細胞內外連接斷開，釋放肝癌細胞；然后ECM降解，肝癌細胞發生遷移；接著肝癌細胞滲透至血液或淋巴管，黏附于內皮細胞；最后導致體內其他部位出現繼發性肝癌細胞生長。近期研究[34]表明，通過調控MMP-2/MMP-9表達活化，可控制肝癌細胞的轉移侵襲能力。在人肝癌細胞中，激活ERK1/2-JNK1/2信號通路顯著降低MMP-2/MMP-9表達；而特異性抑制ERK1/2-JNK1/2可恢復Huh-7細胞的MMP-2/MMP-9表達，促進肝癌細胞侵襲能力[35]。

ECM降解既促進肝癌細胞轉移和侵襲，還提供原發性腫瘤生長的必要空間。由于基底膜破壞，內皮細胞遷移至新生血管，釋放ECM結合因子，血管中氧氣及營養物質的供應也對肝癌細胞生長至關重要。研究表明MMP-2/MMP-9調控肝臟腫瘤內新生血管生成。Yoshiji等[36]發現，小鼠肝癌組織MMP-2/MMP-9活性上調，通過介導血管內皮生長因子和血管生成素2的協同作用調控腫瘤血管生成和HCC發展。在人肝癌細胞HepG2和Hep3B中，過氧化物酶體增殖劑激活受體γ通過抑制下游septin-2蛋白功能，下調MMP-2/MMP-9表達，抑制血管生成和肝癌細胞生長[37]。此外，MMP-9還可影響肝癌細胞存活和凋亡。MMP通過剪切黏附分子，調控血管抑制素、內皮抑制素分泌等方式促進腫瘤細胞凋亡[38]。Li等[39]發現，高表達MMP-9和低表達microRNA-328-3p的肝癌細胞凋亡率高、增殖能力低，此類肝癌患者病理分期低且總體生存率高。

MMP-2/MMP-9表達還與HCC不良預后相關。HCC患者腫瘤組織高表達促進腫瘤轉移和侵襲的胸苷磷酸化酶，其和MMP-2/MMP-9表達顯著正相關，且和惡性肝癌患者不良預后負相關[40]。通過降低肝癌細胞MMP-2/MMP-9表達，能有效抑制肝癌細胞侵襲相關的β-catenin信號通路活化[41]。Daniele等發現HCC患者中MMP-2和TIMP-2表達均顯著高于健康對照；經肝動脈化療栓塞術治療后，其血清TIMP-2逐漸升高，MMP-2/TIMP-2比率降低，患者存活率增高[42]。因此，MMP-2/MMP-9表達和活化可作為判斷HCC轉移和預后的重要指標。

3.4 MMP-2/MMP-9與肝臟免疫 MMP-2/MMP-9參與多種免疫進程，發揮重要作用。MMP-2是經典趨化因子活性調節分子，可裂解單核細胞趨化蛋白的N端，導致CCL2、CCL4、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15和CXCL12等因子失活，發揮抗炎作用；另一方面，MMP-2也誘導具有巨噬細胞趨化作用的CCL16和CCL23活化[43]。此外，MMP-2可降解補體C1抑制劑，從而維持補體功能。MMP-2表達缺陷可致基因敲除動物補體活化功能嚴重受損[44]。

筆者新近研究發現，MMP-2/MMP-9在肝內病毒特異性CD8+T細胞應答的發生中也發揮重要調控作用。筆者的研究顯示，MMP-2/MMP-9聯合作用可誘導T淋巴細胞膜表面CD100分子裂解釋放至外周血，形成可溶性CD100(sCD100)。sCD100通過與其受體CD72結合，誘導肝內抗原提呈細胞活化從而增強抗病毒CD8+T細胞應答。在慢性HBV感染過程中，患者外周血MMP-2表達水平顯著下降，從而造成其血清sCD100水平低下，無法誘導有效的肝內HBV特異性CD8+T細胞應答，導致病毒感染持續[45]。

4 總結

從MMP發現至今，對其家族不斷深入的研究表明：MMP不僅是能夠降解多種蛋白質和分子的酶，還具有復雜的免疫調節作用。其中，MMP-2/MMP-9在多種CLD進程中發揮重要作用，這與疾病發展過程中多種信號通路，特別是炎癥及免疫分子信號通路密切相關。因此，全面研究MMP-2/MMP-9生物免疫學效應，對于深入闡明相關肝臟疾病進展過程具有重要意義，并為探索新的治療方法和策略奠定基礎。

作者貢獻聲明：楊尚青負責綜述立題，撰寫論文；楊東亮參與指導修改論文；劉嘉負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

表2 MMP-2/MMP-9對HCC的影響