外泌體在肝細胞癌中的作用

姚韻婷， 周遠忠， 劉 俊

遵義醫科大學公共衛生學院， 貴州 遵義 550004

目前關于外泌體的功能已經被越來越多的學者關注，大部分細胞中均可分泌外泌體。在肝臟中，外泌體來源于3種細胞：肝細胞、非實質免疫細胞[如Kupffer細胞、自然殺傷(NK)細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞]和非實質肝細胞(如肝星狀細胞)，作為細胞外卵泡的一個亞型，外泌體參與許多正常和病理過程，尤其對于腫瘤發生發展的調控作用[1]。外泌體通過調節細胞外通訊，在腫瘤的耐藥性、血管生成、上皮-間充質轉變(EMT)和轉移中發揮重要作用[2]。一方面，腫瘤細胞通過外源體沖擊相鄰細胞，建立致瘤微環境；另一方面，基質細胞[如肝星狀細胞和間充質干細胞(MSC)]和免疫細胞可以影響腫瘤細胞，通過外泌體促進或預防腫瘤發生[3]。尤為重要的是，外泌體的多功能作用主要由它們的供體細胞和它們的含量決定，包括脂質、核酸和蛋白質(圖1)[4]。此外，外泌體由于其眾多特征而具有治療工具的潛力，本文將對此進行綜述分析。

1 外泌體合成

近年來，外泌體作為腫瘤發生的主要調控因子引起學者的極大關注。最新研究[5]顯示，外泌體產生的主要機制為轉運所需的內吞體分選轉運復合體(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)(圖2)， 并將其首次定義為酵母中的泛素依賴性蛋白質分揀途徑。Vps-4是ESCRT復合物的組合物之一，被稱為具有ATP結合結構域的多聚體機械酶，其結合ESCRT-Ⅲ亞基然后通過ATP脫水以使它們與細胞膜解離而提供能量[6]。Wei等[7]發現，Vps-4的下調是影響肝細胞癌(HCC)患者無復發生存的獨立危險因素，研究表明，Vps-4A與抑制HCC細胞衍生的外泌體生物活性和受體細胞對外泌體的反應有關，其中PI3K/Akt信號通路可能是一種候選機制。這項研究讓學者認識到外泌體的產生與腫瘤的進展、轉移和不良預后有關。

2 外泌體轉運物質

據報道[8]，與非癌細胞相比，癌細胞產生和分泌大量外泌體作為腫瘤誘導劑。其中外泌體在操縱腫瘤細胞微環境中起關鍵作用。重要的是，證實了外泌體的功能主要通過所轉運的物質所確定，在不同情況下發揮不同功能。因此，筆者總結了HCC患者外泌體中發現的分子，包括蛋白質和RNA[miRNA、長鏈非編碼RNA(lncRNA)]，目的是闡明外泌體促進HCC進展的機制。

2.1 蛋白質 根據Vesiclepedia數據庫，外泌體中蛋白質的數量約為1800種，而在HCC細胞系衍生的外泌體中，通過質譜分析發現了213種獨特的蛋白質[9]。外泌體蛋白包括貨物蛋白和膜蛋白，具體取決于外泌體中的位置[10]。研究[11]顯示，在腫瘤的不同進展期，外泌體中的貨物蛋白質組成是不同的。

2.2 核酸 考慮到肝活檢是監測和評估肝臟疾病的金標準，但是其具有出血和感染的風險，因此迫切需要尋求非侵入性診斷工具[12]。因此，“液體活檢”成為目前研究的焦點，“液體活檢”是通過血清外泌體的檢查，實現HCC的早期診斷和預后預測[13]。在HCC外泌體中，除蛋白質外，已經證明[14]檢出核酸，特別是miRNA，也是外泌體的組合物之一(表1)。Kogure等[23]已經證實了在Hep3B分泌的外泌體中，共有134種miRNAs表達，與其供體細胞相比較，其中11種miRNAs為Hep3B特殊表達的miRNA。Li等[24]報道，miR-429是HCC的重要預后因子，被分泌到外泌體中并被受體細胞攝取。Sohn等[25]比較了HCC、慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)患者血清中外泌體miRNA的水平，結果顯示，與CHB相比，HCC患者中miR-18a、miR-221和miR-222的表達水平顯著更高，miR-101、miR-106b、miR-122和miR-195的表達水平更低。這些研究顯示，外泌體轉運物質中miRNA可能成為HCC診斷和預后預測的潛在生物標志物。在HCC中發現的miRNA見表1。

Sugimachi等[22]已經證明miR-718可以作為預測手術后HCC復發的術前生物標志物，肝移植術后HCC復發患者外泌體中miR-718的表達水平顯著低于無HCC復發的患者。此外，經驗證的隊列研究[26-27]表明，miR-718的表達降低和潛在靶基因HOXB8的過表達與腫瘤侵襲性和不良預后相關。另外，Liu等[20]報道，在HCC患者中，外泌體miR-125b可作為患者預后標志物，是HCC患者復發時間以及總體存活的獨立因素。

盡管目前研究[15]證實外泌體中miRNA表達可能是反映供體細胞特征的有用工具，可能成為腫瘤發生發展及預后的潛在生物標志物，但目前外泌體miRNA在HCC發生發展中的作用仍知之甚少。此外，miRNA表達水平和功能在特定條件下存在爭議，一些隊列研究不包括健康參與者，因為與健康人相比，從肝病患者中收集血清樣本更具便利性[28]。

最新研究[29]集中在除miRNA之外的lncRNA在外泌體中的作用。lncRNA定義為長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。lncRNA-ROR和lncRNA-LVDR其在HCC衍生的外泌體中被檢出。最近研究[30]發現，與供體細胞相比，lncRNA在細胞外囊泡的表達更為保守。例如，被命名為TUC339的lncRNA在HCC細胞衍生的外泌體中被檢出，并認為其具有促進HCC生長以及擴散的功能[25]。最重要的是，這些研究探索了通過外泌體在細胞內轉移的核酸，具有調節腫瘤細胞并起到細胞內信號傳導介質的作用[31]。

3 外泌體與受體細胞相互作用的機制

近年來，學者廣泛研究了受體細胞對外泌體攝取的動態調節[32]。有幾種模型被認為是受體細胞外泌體內化的可能機制，包括受體介導的內吞作用和經典的液相內吞作用(圖3)[33]，后者被認為是缺乏特異性的微泡內化的常用方法。

相反，受體介導的胞吞作用由于其具有細胞特異性而引發學者的興趣，使得外泌體進一步修飾后用于治療成為可能[34]。整合素是外泌體膜上常見的受體之一，已經發現外泌體整聯蛋白具有預測轉移器官的能力。例如，外泌體表達人整合素αvβ5(human integrin αvβ5，ITGαvβ5)特異性地結合到Kupffer細胞，介導肝臟趨向性，而外泌體ITGα6β4和ITGα6β1結合肺成纖維細胞和上皮細胞，介導肺臟趨向性[35]。因此，通過外泌體整合有助于腫瘤轉移的預防。

表1 HCC外泌體中發現的miRNAs

此外，封閉清道夫受體A類家族(SR-A)，作為一種新的外泌體單核細胞/巨噬細胞攝取受體，體內含硫酸葡聚糖，通過小鼠肝臟中的外泌體清除來增強腫瘤積聚[36]。這些發現是使外泌體腫瘤治療成為可能。

值得關注的是，攝取外泌體的過程并不總是調節受體細胞功能所必需的；同時它是運輸外泌體物質的基礎。Muller等[37]表明，腫瘤來源的外泌體介導調節性T淋巴細胞抑制因子功能依賴于細胞表面信號傳導，并且不需要受體細胞進行外泌體內化。

此外，從癌癥患者血清中分離的外泌體觀察到受體細胞的致癌轉化。并與受體細胞中腫瘤抑制基因突變現象具有協同作用。總的來說，這些結果提示了腫瘤細胞的轉移可能不是必要的轉移，可以通過外泌體運輸來實現。

4 外泌體在HCC進展中的作用

由于肝臟是一個多細胞器器官，細胞間通訊在肝臟生理學和病理學中是必不可少的，包括腫瘤發生[38]。除自分泌、旁分泌和細胞-細胞接觸外，外泌體提供新的細胞間通訊形式[39]。該過程可能受許多因素的影響，如微環境pH、致癌轉化和應激反應。外泌體在HCC進展中的作用已得到廣泛研究。源自HCC細胞的外泌體miRNA激活TGFβ激酶1和下游信號分子，導致受體細胞的進一步生長，表明外泌體具有調節受體細胞信號傳導和生物效應的能力[18]。

4.1 外泌體參與HCC化療耐藥 索拉非尼是美國食品藥品監督管理局批準的用于晚期HCC的一線分子靶向藥物[40]。然而，在長期索拉非尼治療后，HCC細胞表現出對索拉非尼的抗性。越來越多的證據[41]表明，外泌體也參與了HCC的化學抗性。

首先，外泌體促進藥物外排以產生化學抗性，腫瘤細胞可以通過外泌體包裹來外排抗癌藥物和代謝物。Safaei等[42]發現，lncRNA-LVVDL在HCC細胞中的表達在不同的抗腫瘤藥物包括索拉非尼的存在下增加。此外，在HCC細胞衍生的外泌體中也發現了lncRNA-LVVDL的過表達，表明癌細胞不僅經由外泌體消除化學藥物，而且通過誘導分子轉移來維持化學抗性[43]。

其次，在化學藥物存在下，外泌體通過增強腫瘤細胞的活力而參與化學抗性。Qu等[44]首次表明，源自HCC細胞的外泌體可抑制索拉非尼誘導的細胞凋亡，從而發揮索拉非尼抗性，其潛在的機制可能是HCC外泌體誘導肝細胞生長因子在HCC細胞中的過表達，并激活c-Met磷酸化和下游信號傳導途徑，例如PI3K/Akt和MAPK/Erk途徑。Takahashi等[45]還發現，索拉非尼可增加HCC中lncRNA-ROR的表達，而lncRNA-ROR可選擇性地富集外泌體以響應TGFβ，從而調節化療誘導的細胞凋亡并允許細胞在化學治療應激下通過p53依賴性方式存活。

這些結果表明，外泌體參與化學治療反應調節，并提供可能成為HCC細胞化學敏感性治療的靶點。

4.2 外泌體調節腫瘤細胞的EMT EMT是癌癥遠處轉移的最初步驟，腫瘤細胞的遷移和侵襲通過EMT過程實現，從而導致癌癥的轉移[46]。外泌體的出現為EMT的研究提供了新的視角。例如，已經發現在從多形核白細胞衍生的外泌體接收miR-223后，在癌細胞中可出現EMT重編程[47]。然而，miR-223的這種影響是短暫的，因為它迅速被核酸外切酶失活XRN1，表明異位miRNA和內源性的miRNA以不同的方式行動[48]。此外，已發現MSC衍生的外泌體在許多不同癌癥類型的相鄰上皮細胞中誘導EMT。

總之，這些結果支持外泌體參與EMT的觀點，并與癌細胞侵襲、轉移有關[19]。然而，需要更多的研究來更好地理解外泌體調節HCC中EMT的確切機制。

4.3 外泌體促進HCC組織中的血管生成 已經證明經歷EMT的癌細胞能夠通過外泌體有效地將血管生成蛋白轉移到受體內皮細胞。此外，外泌體在嚴峻條件，如氧或營養缺失，化療藥物刺激和乙醇暴露下，在HCC組織中分泌增加[49]。其中，氧氣和營養缺乏是血管生成的主要原因。這些結果使研究者假設在嚴峻條件下，癌細胞通過外泌體傳遞血管生成分子以建立促進腫瘤的微環境[16]。在由Gonzalez-King進行的研究中，顯示缺氧的MSC衍生的外泌體通過水平轉移Jagged-1并激活內皮細胞中的下游Notch途徑誘導血管生成[50]。Sruthi等[21]研究發現，HepG2細胞在細胞質低氧條件下外泌體miR-23a下調，受體細胞SITR1表達處于較高水平并促進外泌體分泌，從而誘導血管生成。

越來越多的證據表明腫瘤微環境中確實像存在癌癥干細胞(cancer stem cell，CSC)和血管生成之間的關系，稱為“串擾”，其協同促進腫瘤生長[51]。例如，Morrow等[52]表明，CD90+CSC等干細胞可通過外泌體影響上皮細胞。在外泌體內化后，在上皮細胞中觀察到血管內皮生長因子產生和形成的水平增加。通過鑒定lncRNA譜，發現lncRNA H19富含CD90+CSC類似于肝細胞衍生的外泌體，并且可以是血管生成的主要介質和HCC的治療靶點[53]。

除細胞內環境外，外源刺激如乙醇暴露等多種途徑均可誘導血管生成內皮表型。Lamichhane等[17]報道乙醇通過下調抗血管生成miRNA(miR-106b)和上調促血管生成的lncRNA(肺癌轉移相關轉錄本1和HOX轉錄反義RNA)來增加內皮細胞衍生的血管生物活性。重要的是，這可能是乙醇引起HCC的分子機制之一。

4.4 外泌體促進HCC轉移 由于HCC的高轉移率和高術后復發率，HCC的長期生存率較低。腫瘤轉移是一個多步驟的過程，包括侵入、血管轉移,并通過循環系統遠端部位的定植。上面已經描述了轉移的最初步驟。

目前研究發現，無論是來源于癌細胞的外泌體或鄰近的基質細胞外泌體，均具有促進腫瘤細胞轉移的作用。各種致癌RNA和蛋白質，如MET原癌基因、caveolins和S100的家庭成員，均在HCC細胞系來源的外泌體轉錄組和蛋白質組被發現[54]。肝細胞對這些外泌體的內化激活PI3K/AKT和MAPK信號傳導途徑，并增加有利于細胞侵襲的基質降解蛋白酶MMP-2和MMP-9。此外，Zhang等[55]研究證明，HCC相關成纖維細胞衍生的外泌體miR-320a表達降低，導致造血相互作用蛋白在受體細胞失調，從而引起癌細胞肺轉移。結果表明，外泌體可動員正常肝細胞從而構建致癌微環境，最終引發腫瘤細胞轉移。

4.5 外泌體引發免疫反應 免疫耐受是肝臟獨特的免疫微環境，是治療HCC免疫治療的主要障礙。外泌體引發免疫反應是矛盾的。一方面，外泌體存在于多種已知的免疫抑制機制中，例如免疫抑制細胞的激活，抗原遞呈缺陷和T淋巴細胞凋亡的誘導。另一方面，外泌體是由腫瘤細胞和免疫細胞暴露腫瘤抗原的主要來源。例如，Zhang等[56]證明了抗癌藥物刺激HCC衍生的外泌體分泌并產生更多的外泌體攜帶熱休克蛋白，其被稱為“應激反應”蛋白。根據上述研究，攜帶熱休克蛋白的外泌體可通過多種機制刺激有效的抗腫瘤免疫反應，同時刺激NK細胞細胞毒性顆粒酶B的產生，上調抑制性受體CD94的表達，下調活化受體CD69、NKG2D和NKp44的表達。

Deng等[57]比較了由HCC細胞衍生的外泌體引發的免疫應答水平，研究表明，在用HCC TEX脈沖的樹突狀細胞(DC)處理的HCC小鼠中觀察到T淋巴細胞數量增加，IFNγ表達增加，IL-10和腫瘤生長因子β水平降低。這些結果表明，外泌體攜帶腫瘤相關抗原呈現給DC，并引發DC介導的免疫應答。

此外，Lu等[58]證明，在用HCC抗原修飾的DC(AFP-表達DC)衍生的外泌體處理的HCC小鼠中觀察到有效的T淋巴細胞活化。這些發現表明外泌體不僅將腫瘤相關抗原從腫瘤細胞遞呈給抗原遞呈細胞，而且還能夠將它們遞呈給引起抗原介導的抗腫瘤免疫應答的T淋巴細胞，這為無細胞疫苗極大地促進了HCC免疫療法的發展。

有研究認為，在細胞營養缺乏條件下外泌體的分泌與正常狀況有所不同，可能由于營養缺乏對免疫功能的影響引起外泌體分泌條件的改變，進而進一步誘發后續的連鎖反應而影響患者預后。 外泌體在細胞營養缺乏和營養條件正常情況下的分泌有所不同，考慮是因營養缺乏對免疫功能影響，而外泌體在很多生理病理上起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等。不同細胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物。來自美國萊斯大學等多個研究單位的研究人員共同揭示了腫瘤微環境通過外泌體為癌細胞提供營養物質幫助癌細胞度過營養匱乏等情況的新機制。CAF來源的外泌體(CDEs)抑制了線粒體氧化磷酸化,因此增加了糖酵解和谷氨酰胺依賴的還原羧化作用, 外泌體提供氨基酸給營養被剝奪的癌細胞，采用一種類似巨吞的機制。利用外泌體導入機制，作者提供了足夠充足的證據，CDEs包含完整的代謝產物，包含氨基酸、脂質和三羧酸循環中間體，這些被癌細胞如饑似渴地利用，在營養缺乏和壓力環境下幫助腫瘤成長。

另一方面可能是因為外泌體操縱腫瘤微環境的另一個例子是誘導血管生成。血管生成是利用已存在的血管形成血管的自然過程，在生物體的生長發育過程中以及對損傷的反應中很常見。然而，這一過程在癌癥進展中也是必不可少的，因為腫瘤生長需要血管系統的快速形成來提供營養、氧氣和廢物的清除。當腫瘤微環境是缺氧狀態時，會促進細胞外胞囊的形成與釋放，改變細胞外胞囊的含量與組成，從而激活內皮細胞，刺激血管形成，幫助腫瘤克服氧氣及營養的缺乏環境，以至于促進諸如轉移的腫瘤進程。研究發現外泌體通過miRNA、mRNA和蛋白質的遞送在血管生成中發揮重要作用。例如，有研究[59-60]報道白血病細胞來源的外泌體過表達miR-92a(即一種屬于miR-17-92簇的miRNA)進入內皮細胞，并導致遷移和血管生成的增強。此外，Delta-like 4(Dll4)是一種膜結合的Notch配體，在血管發育和血管生成中起著重要作用，可以被外泌體通過3D膠原基質轉運到遠處的細胞。研究表明腫瘤微環境內的癌癥相關成纖維細胞能夠通過分泌外泌體為癌細胞提供氨基酸等營養物質，這表明靶向癌癥相關成纖維細胞或可成為新的癌癥治療方向，除此之外未來或還可以利用外泌體進行藥物輸送達到癌癥治療的目的。但關于機體營養對外泌體分泌的影響，還需要深入的研究分析。

4.6 外泌體是一種很有前途的抗癌治療藥物 細胞膜衍生的納米顆粒具有保護其載物、免疫原性低、通過內皮形成適當尺寸等特點，可作為藥物傳遞劑。例如，Yu等[61]報道了脂肪來源的MSC具有經由外泌體轉移的miR-122，由此加強HCC細胞對化學治療劑的敏感性。有研究[62]已經證明，miR-122負調節的去整合素以及金屬蛋白酶家族成員17(adisintegrinandmetalloproteinase 17，ADAM17)、ADAM10、IGF1R和MADS-box轉錄因子SRF，與HCC患者預后差、腫瘤轉移有關。

由于MSC是細胞最常見的外源性外泌體生產者之一，被學者廣泛關注。除了脂肪源性MSC，117種骨髓來源的外泌體常用于干細胞的治療中。此外，報道顯示，DC衍生的外泌體可用作癌癥疫苗。Yukawa等[63]提出，通過靶向用于藥物遞送囊泡配體進行外泌體修飾，具有著潛在的臨床應用價值。例如，用Arg-Gly-Asp(RGD)肽修飾外泌體膜可引發血管靶向作用，這可能是治療性血管生成的新方向。同時，據報道外泌體參與了抗化療藥物抗性，并且一些研究表明抑制外泌體分泌在使癌細胞對治療藥物敏感方面是有效的。總之，外泌體是HCC治療的新方向。

5 結論

惡性腫瘤與外泌體之間的關系一直是過去幾年的一個研究熱點。此綜述闡述了目前HCC發生發展中與外泌體的關系。目前研究認為，外泌體通過多種致瘤過程促進HCC進展，包括化學抗性、EMT、血管生成、腫瘤轉移以及免疫應答。外泌體作為HCC藥物遞送劑，有望成為HCC治療的新方向。這些發現為探索HCC的新治療工具提供了框架。然而，由于缺乏關于外泌體的臨床安全性和功效的信息，研究受到限制。因此，還需要進一步的研究以更好地了解外源體與HCC發展的關系。

作者貢獻聲明：姚韻婷等負責課題設計，資料分析，撰寫論文；周遠忠等參與收集數據，修改論文；劉俊等負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。