鼠麴草對大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療作用及其機(jī)制*

黃蕾，楊全偉，夏俊鋒，劉新國

(1.武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022；2.湖北省仙桃市公共檢驗(yàn)檢測中心，仙桃 433000)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis，GA)是由于血液中尿酸增高及尿酸鹽結(jié)晶(sodium urate crystal，MSU)析出，沉積在關(guān)節(jié)組織引起關(guān)節(jié)滑膜及周圍組織炎癥反應(yīng)和病理性損傷。該病致殘率和致畸率較高，給患者生活和健康帶來不便[1-2]。固有免疫在GA發(fā)展中起重要作用，多種免疫細(xì)胞及炎癥因子通過識(shí)別尿酸鈉，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，進(jìn)而調(diào)控凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)成熟，其中NALP3炎性體(NACHT-LRR-PYD-containing proteins-3，NALP3)是該過程中重要的信號(hào)活化產(chǎn)物[3]。NALP3由3部分組成：NLR家族蛋白、ASC起連接作用、caspase-1。3個(gè)組成部分均在MSU誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4-5]。

鼠麴草具有祛風(fēng)除濕功效，是治療咳嗽、哮喘和痛風(fēng)的傳統(tǒng)中草藥[6]。筆者在本研究通過制備GA大鼠模型，并給予不同劑量鼠麴草進(jìn)行干預(yù)，觀察鼠麴草對GA的治療效果以及與NALP3炎性體信號(hào)通路的關(guān)系[7]。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，6～8周齡，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2019-0009，飼養(yǎng)條件：12 h明暗交替，溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2藥品與試劑 鼠麴草藥材飲片購自安徽省亳州市仁惠堂中藥材銷售有限公司，樣品經(jīng)湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院李丹平主任藥師鑒定為菊科植物鼠麴草(GnaphaliumaffineD.Don)的全草；秋水仙堿片(廣州彼迪藥業(yè)有限公司，批號(hào)：180921)；尿酸鈉(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：180813)，尿酸(uric acid，UA)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)、IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒(均購自南京建成生物科技有限公司，批號(hào)分別為20190605，20190703，20190313，20190625)，兔抗大鼠NALP3單克隆抗體、兔抗大鼠ASC單克隆抗體、兔抗大鼠caspase-1單克隆抗體、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(上海碧云天生物科技有限公司，批號(hào)分別為AF2155、AF1681、AF0246、AF0003)。

1.3儀器與設(shè)備 CLF-40型密封型手提式粉碎機(jī)(廣州大祥電子器械廠)，ZNHW-II電熱套(山東甄誠實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器)，TG16G型低溫高速離心機(jī)(常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠)，電子天平(德國賽多利斯公司，BP190S型，感量：0.1 g；BSA124S型，感量：0.1 mg)，BW-PVM802型足趾容積測量儀(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)，ELX800型酶標(biāo)儀(青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司)，ChemiDocXRS型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，AR-21型組織染色機(jī)(湖北安立信醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司)，CX31型生物顯微鏡(奧林巴斯有限公司)。

1.4鼠麴草醇提物的制備 將鼠麴草干燥后打成粗粉，取粗粉1 kg，加95%乙醇8 L，浸泡過夜后連續(xù)加熱回流提取2次，藥材殘?jiān)^續(xù)以同體積80%乙醇提取1次，將3次提取液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得黏稠浸膏，真空干燥得總醇提干浸膏156 g，臨用前用純化水稀釋成所需要濃度[8]。

1.5模型的制備 精密稱取適量尿酸鈉，以0.9%氯化鈉溶液和聚山梨酯-80溶解，配制成20 mg·mL-1尿酸鈉溶液。將大鼠仰臥固定于解剖板，右后肢小腿踝關(guān)節(jié)75%乙醇消毒，6號(hào)注射針以踝關(guān)節(jié)外側(cè)為穿刺點(diǎn)，針口斜面朝上且與脛骨成45°刺入踝關(guān)節(jié)腔，注入尿酸鈉液，每個(gè)關(guān)節(jié)0.2 mL，建立大鼠GA模型，正常對照組于相同部位注射等體積0.9%氯化鈉溶液[9-10]。

1.6分組及給藥 將大鼠隨機(jī)分為6組：正常對照組，模型對照組，鼠麴草小劑量組、中劑量組、大劑量組，秋水仙堿組，每組10只。造模同時(shí)正常對照組和模型對照組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，鼠麴草小劑量組、中劑量組、大劑量組分別給予醇提物藥液0.4，0.8，1.6 g·kg-1灌胃，秋水仙堿組給予秋水仙堿0.97 mg·kg-1灌胃。均每次2 mL，連續(xù)8 d。

1.7大鼠足跖腫脹率評(píng)價(jià) 于造模后1，8，12，24，48 h，用足趾容積測量儀測定各大鼠右后足跖容積，計(jì)算足跖腫脹率。足跖腫脹率(%)=(造模后足容積-造模前足容積)/造模前足容積×100%[11]。

1.8血清相關(guān)指標(biāo)檢測 實(shí)驗(yàn)第8天，給藥30 min后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定于解剖板，取腹主靜脈血，分離血清，收集關(guān)節(jié)液，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)錂z。按照相關(guān)試劑盒操作步驟，檢測血清UA、XOD、IL-1β、TNF-α。

1.9滑膜組織NALP3、caspase-1、ASC蛋白表達(dá)檢測 采用蛋白免疫印跡法(Western blotting)。取大鼠左后足膝關(guān)節(jié)滑膜組織，液氮速凍，加入放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液及蛋白酶抑制劑充分勻漿，4 ℃ 12 000 r·min-1(r=24 cm)離心15 min取上清液。取等量蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃下與NALP3(1：200)、ASC(1：200)、caspase-1，(1：5000)或β-actin(1：5000)抗體共同孵育過夜，再與相應(yīng)二抗室溫下共同孵育1 h，滴加化學(xué)發(fā)光試劑(electrochemilu-minescence，ECL)后成像系統(tǒng)檢測分析信號(hào)。以目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值A(chǔ)比值代表目的蛋白相對表達(dá)量。

1.10組織病理學(xué)檢測 取血后處死大鼠，快速分離踝關(guān)節(jié)周圍軟組織，10%甲醛溶液固定，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)情況并攝像。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1大鼠足跖腫脹率 與正常對照組比較，模型對照組各時(shí)間點(diǎn)足跖腫脹率顯著升高(P<0.01)，表明造模成功。與模型對照組比較，鼠麴草小劑量組、中劑量組、大劑量組12～48 h腫脹率顯著降低(P<0.05或P<0.01)，并呈量效關(guān)系，秋水仙堿組8～48 h足跖腫脹率顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表1。

2.2UA、XOD、IL-1β、TNF-α水平 與正常對照組比較，模型對照組UA、XOD、IL-1β及TNF-α含量均明顯增高(P<0.01)。與模型對照組比較，鼠麴草各劑量組與秋水仙堿組UA、XOD、IL-1β、TNF-α含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表2。

2.3滑膜組織NALP3、Caspase-1、ASC蛋白表達(dá) 與正常對照組比較，模型對照組滑膜組織NALP3、Caspase-1、ASC蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；與模型對照組比較，鼠麴草各劑量組與秋水仙堿組滑膜組織NALP3、Caspase-1、ASC蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見圖1和表3。

2.4大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜病理特征 正常對照組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)清晰，滑膜細(xì)胞排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤，無滑膜細(xì)胞增生和毛細(xì)血管充血、水腫；模型對照組滑膜炎癥明顯，出現(xiàn)滑膜組織明顯水腫，滑膜細(xì)胞排列紊亂伴細(xì)胞增生，并出現(xiàn)毛細(xì)血管增生，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤等炎癥表現(xiàn)；與模型對照組比較，鼠麴草小劑量組、中劑量組、大劑量組及秋水仙堿組滑膜炎癥反應(yīng)均有不同程度減輕，中劑量組、大劑量組與秋水仙堿組病變減輕程度相當(dāng)，炎癥細(xì)胞少量、分散浸潤。結(jié)果見圖2。

表1 6組大鼠足跖腫脹率

表2 6組大鼠血清UA、XOD、IL-1β、TNF-α水平

A.正常對照組；B.模型對照組；C.鼠麴草小劑量組；D.鼠麴草中劑量組；E.鼠麴草大劑量組；F.秋水仙堿組。

Fig.1TheproteinexpressionofNALP3，Caspase-1andASCinsynovialtissueofrats

3 討論

GA是由于嘌呤代謝紊亂或尿酸排出障礙導(dǎo)致的血UA升高，MSU沉積于組織或器官，引起組織損傷的一組臨床綜合征[12-13]。MSU沉積于細(xì)胞外，即能被細(xì)胞膜上Toll樣受體識(shí)別，促使前體1L-1β合成，IL-1β被認(rèn)為是最經(jīng)典的炎癥調(diào)節(jié)劑，是炎癥調(diào)節(jié)的始動(dòng)因素，可以啟動(dòng)和調(diào)節(jié)眾多與炎癥反應(yīng)有關(guān)因子的IL-1、IL-6、TNF-α等表達(dá)[14-15]。XOD是體內(nèi)催化黃嘌呤、次黃嘌呤氧化生成尿酸的酶，而血UA升高是痛風(fēng)的重要生化基礎(chǔ)，二者均是痛風(fēng)發(fā)生發(fā)展的體內(nèi)重要標(biāo)志物[16]。研究表明，敲除NLRP3/ASC/caspase-1的小鼠用MSU晶體刺激后，IL-1β的成熟和釋放受到明顯抑制，敲除小鼠NLRP3時(shí)，IL-1β的產(chǎn)生同樣受到抑制，注射MSU晶體后，中性粒細(xì)胞聚集消弱，證實(shí)NLRP3炎性體在痛風(fēng)急性發(fā)作中發(fā)揮了重要作用[17-18]。

表3 6組大鼠滑膜組織NALP3、Caspase-1、ASC蛋白表達(dá)

A正常對照組；B.模型對照組；C.鼠麴草小劑量組；D.鼠麴草中劑量組；E.鼠麴草大劑量組；F.秋水仙堿組。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MSU顯著升高XOD活力，血UA也隨之顯著升高，給予小劑量、中劑量、大劑量鼠麴草干預(yù)后，二者水平均顯著降低。MSU可顯著增加IL-1β及TNF-α水平，而鼠麴草提取物能顯著降低這些炎癥因子的水平。模型對照組ASC、caspase-1和NALP3蛋白表達(dá)量顯著上升，IL-1β釋放減少，可能是MSU激活NALP3信號(hào)通路，上調(diào)IL-1β表達(dá)，促進(jìn)了GA炎癥反應(yīng)發(fā)生和進(jìn)展，鼠麴草各劑量組與秋水仙堿組NALP3/ASC/caspase-1蛋白表達(dá)顯著下降，NALP3炎癥體的組裝被抑制，IL-1β的釋放減少。綜上所述，鼠麴草對大鼠GA有顯著治療作用，其作用機(jī)制可能與抑制NALP3炎性體激活、抑制XOD活性、減少UA生成、抑制炎性反應(yīng)有關(guān)，本研究為進(jìn)一步探索鼠麴草治療GA的作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

本研究存在一定局限性，炎癥通路除了NALP3炎性體信號(hào)通路外，還有MAPK、TLRs等信號(hào)通路，本實(shí)驗(yàn)只選取了部分通路研究，對其他炎癥通路并未涉及。另外發(fā)現(xiàn)鼠麴草治療GA的藥效較秋水仙堿稍弱，這可能與本實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)間較短有關(guān)，需要更長時(shí)間考察其藥效。其次鼠麴草含有多種有效成分如黃酮類、三萜類、植物甾醇和咖啡酸衍生物等，筆者后續(xù)研究將選篩選出有效單體來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步明確鼠麴草治療GA的藥理成分，解決其成分復(fù)雜作用不明確的問題。