雪膽素甲對小鼠乳腺腫瘤的抑制作用及其機制*

吳璐璐，田瑜，龔令熙，黃光英

(陸軍軍醫大學第二附屬醫院藥劑科，重慶 400038)

乳腺腫瘤是當前全球女性發病率最高的腫瘤疾病，每年因罹患乳腺腫瘤死亡的婦女約52萬例，乳腺腫瘤高居女性惡性腫瘤死亡第一位[1]。2012年數據顯示，中國女性乳腺癌新發約19萬例，死亡近5萬例。雖然按統計中國乳腺癌發病率仍屬低發，但呈逐年上升趨勢[2]。目前，惡性乳腺腫瘤的治療尤其是三陰性乳腺腫瘤的治療方法進展不多，以手術切除和放化療結合為主要治療手段。化學治療(化療)常規藥物為蒽環類、抗代謝類、鉑類、紫杉類及內分泌輔助藥物如他莫昔芬、托瑞米芬等[3]。上述治療藥物均存在靶向性差、全身性毒副作用明顯、癥狀改善能力有限等缺點。其他如分子靶向藥物曲妥珠單抗、利妥昔單抗等價格昂貴，普通患者難以承受。因此，開發高效、低毒和價廉的乳腺腫瘤治療藥物是新藥研發的重點和難點。

近年來，中藥復方黃黛片等[4]治療腫瘤取得進展。中藥雪膽(HemsleyachinensisCogn.ex Forbes et Hemsl.)為葫蘆科植物雪膽Hemsleyaamabilis Diels的干燥塊根，能清熱解毒、消炎殺菌[5]，臨床用于胃炎、胃潰瘍及呼吸道感染等的治療。近來研究發現，其三萜類成分雪膽素甲對非小細胞肺癌有一定抑制作用[6-7]。筆者在本實驗觀察雪膽素甲(cucurbitacin α，CUBα)對乳腺腫瘤模型小鼠腫瘤的抑制作用并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1試藥 CUBα，含量不低于90%(高效液相色譜法測定)，購于遼寧大連美侖化學試劑公司，批號：160325；橄欖油，購于西安天龍試劑公司，批號：TA15060；二甲基苯蒽(methylnitrosourea，DMBA)，批號：089K073，純度≥95%，購于美國Sigma公司；他莫昔芬，奧地利Ebewe Pharma公司產品，批號：612487-72-6；10%水合氯醛，購于重慶醫科大學附屬兒童醫院，批號：20180516；無水乙醇，化學純，購于重慶浩康醫藥化工集團有限公司，批號：20161205。Na+-K+-ATP酶、 Ca2+-Mg2+-ATP 酶、超氧化物歧化酶(SOD) 、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性檢測試劑盒，雌二醇和孕酮酶聯免疫試劑盒(均購自武漢華美生物工程有限公司，批號分別為171020、170806、170628、171011、170906)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)酶聯免疫試劑盒購自南京建成生物技術公司，批號分別為20171218和20180115。

1.2儀器與設備 UV2000紫外分光光度計(日本島津公司)；全波長掃描酶標儀(美國Thermo科技公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；飛鴿TGL-16B臺式高速離心機(離心半徑8.76 cm，上海安亭科學儀器廠)；多功能小鼠活動記錄儀(上海智尚醫學設備公司)。

1.3實驗動物 雌性Balb/c小鼠，無特定病原體(SPF)級，7～8周齡，體質量(19.2±3.6) g，購于重慶醫科大學動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(渝)2012-0002。小鼠常規飼養，自由飲水，實驗開始前適應性飼養5 d。

1.4動物的造模與處理 實驗小鼠以普通標準飼料喂養3 d，按體質量采用配對設計隨機分組法分為6組，每組12只，即空白對照組、模型對照組、他莫昔芬(陽性對照)組和CUBα小劑量組、中劑量組、大劑量組。模型對照組、他莫昔芬組(陽性對照組)和CUBα 小劑量、中劑量、大劑量組參照文獻[8]方法并改良，造模，每3 d給予15 mg·mL-1DMBA橄欖油溶液 8 μL皮下注射，連續8周，以手觸摸小鼠有腫瘤出現為止；他莫昔芬組造模開始時按5 mg·kg-1·d-1灌胃給予他莫昔芬混懸液(0.9%氯化鈉溶液混懸，0.2 mg·mL-1)；CUBα各劑量組按12.5，25，50 mg·kg-1·d-1灌胃給予 CUBα混懸液(0.2%聚山梨酯-羧甲基纖維素鈉混懸，30 mg·mL-1)；空白對照組灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液；停止DMBA后繼續給藥16周，迅速斷頭處死(為避免麻醉藥對檢測指標影響)，取血液，剝離臟器及腫瘤組織，血漿置-80 ℃保存備用。組織除需立即檢測外，其他以4%甲醛固定備用。實驗過程中小鼠均給予普通標準飼料喂養。

1.5檢測指標

1.5.1一般狀況、雌二醇和孕酮水平 造模開始后，每周觀察小鼠狀態，測量體質量和直腸溫度；監測小鼠 10 min內自主活動次數；實驗開始后第8，16，24周，經眼眶采血0.5 mL，加入有乙二胺四乙酸二鈉的無菌離心管，顛倒離心管混勻，4 ℃靜置30 min，3000 r·min-1離心10 min，取上清液于新離心管，按試劑盒說明書檢測雌二醇和孕酮水平。

1.5.2瘤體和免疫臟器質量檢測 處死小鼠，分離并測定脾臟、胸腺質量，計算抑瘤率、胸腺指數和脾指數。抑瘤率(%)=(模型對照組瘤質量-給藥組瘤質量)/模型對照組瘤質量×100%；臟器指數=胸腺(脾)質量/(體質量×100)。

1.5.3免疫指標檢測 末次給藥24 h后經尾靜脈取血，立即送檢白細胞計數(WBC)；小鼠斷頭所取血漿(乙二胺四乙酸二鈉抗凝)，1200 r·min-1離心5 min，按試劑盒說明書，ELISA法檢測TNF-α和IL-6水平。

1.5.4酶活性檢測 小鼠瘤體和組織以預冷0.9%氯化鈉溶液洗凈、剪碎，制成10%勻漿液，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液，按試劑盒說明書標示法測定組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶、SOD酶、GSH-Px酶活性，其中膜蛋白以小牛血清白蛋白為參比，采用 Lowry 法測定。

1.5.5腫瘤肺轉移觀察 參照文獻[9]方法，取小鼠肺組織，冰冷0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，Bouin液固定過夜，無水乙醇浸泡至顏色恢復。顯微鏡觀察計算白色肺轉移結節數。結節總數(個) =Ⅰ×1+Ⅱ ×2+Ⅲ×3+ Ⅳ×4，按結節直徑分為四級：Ⅰ級<0.5 mm，0.5 mm≤Ⅱ級<1 mm，1 mm≤Ⅲ級≤2 mm，Ⅳ級>2 mm。

2 結果

2.1對小鼠體質量和體溫的影響 開始造模14周后，模型對照組、CUBα小劑量組體溫明顯低于空白對照組(P<0.05)(圖1A)，模型對照組小鼠體質量增長明顯低于空白對照組。他莫昔芬組小鼠體質量增長最緩慢(圖1B)。

A.體溫；B.體質量。

2.2對腫瘤生長進展的影響 結果見表1。造模后16周，空白對照組小鼠未見腫瘤生長；模型對照組小鼠瘤體生長明顯，腫瘤發生率100%，平均瘤體質量(4.72±1.02) g；單因素方差分析結果顯示，與模型對照組比較，給予他莫昔芬(5 mg·kg-1)和中、大劑量CUBα后，瘤體質量均明顯減小(P<0.05)。與他莫昔芬組比較，CUBα中劑量組、大劑量組瘤體質量差異無統計學意義。

2.3對血清性激素的影響 結果見表2。與空白對照組比較，模型對照組小鼠在實驗開始后8周、16周和24周血清雌二醇和孕酮水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組比較，他莫昔芬組小鼠雌二醇(16周、24周)和孕酮(8周、16周和24周)血清水平均顯著降低(P<0.05)。給予不同劑量CUBα后，小鼠血清雌二醇和孕酮水平較模型對照組低，高于他莫昔芬組，但差異均無統計學意義。

2.4對白細胞和免疫器官的影響 結果見表3。與空白對照組比較，模型對照組WBC和脾臟、胸腺臟器指數均有所增加，且差異有統計學意義(P<0.05)。給予他莫昔芬后，荷瘤小鼠WBC降至(9.75±1.22)×109·L-1，脾臟指數和胸腺指數分別減少到(5.97±1.04)和(1.91±0.95) mg·g-1，均顯著低于模型對照組(P<0.01)。給予小劑量、中劑量、大劑量CUBα處理的小鼠，其WBC、脾臟指數和胸腺指數與模型對照組比較，均差異無統計學意義，但明顯高于他莫昔芬，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 6組小鼠瘤體質量與抑瘤率測定結果

表2 6組小鼠激素水平測定結果

Tab.2 Determination results of the hormonal level in six groups of mice

表2 6組小鼠激素水平測定結果

組別雌二醇8周16周24周孕酮8周16周24周空白對照組157.7±12.9112.8±20.877.9±9.232.8±8.127.7±5.021.4±6.5模型對照組218.2±24.1①203.5±15.8①188.2±19.2①43.5±6.4①38.6±9.5①33.5±7.3①他莫昔芬組205.1±11.4141.9±8.5②85.9±6.0②37.1±4.6②31.3±5.1②25.3±3.5②CUBα 小劑量組 228.2±19.1182.8±20.2168.5±15.942.9±8.736.2±5.630.8±7.2 中劑量組198.0±14.7193.9±22.4170.6±17.641.9±7.635.0±6.329.3±2.6 大劑量組187.8±10.6183.3±19.2167.3±24.640.8±10.234.8±5.329.4±3.2

①與空白對照組比較，t=2.865～5.665，P<0.05；②與模型對照組比較，t=3.536～12.997，P<0.05。

①Compared with blank control group，t=2.865-5.665，P<0.05；②Compared with model control group，t=3.536-12.997，P<0.05.

表3 6組小鼠WBC與免疫器官臟器指數測定結果

2.5對免疫相關生化指標的影響 與空白對照組比較，模型對照組小鼠血漿TNF-α和IL-6均明顯增高(P<0.05)。與模型對照組比較，他莫昔芬組TNF-α降低21.1%，差異有統計學意義(P<0.05)，IL-6水平降低但差異無統計學意義；與模型對照組比較，CUBα各劑量組TNF-α和IL-6水平下降并呈劑量相關性。CUBα中劑量、大劑量組TNF-α與IL-6均明顯低于他莫昔芬組(均P<0.05)。與空白對照組比較，CUBα大劑量組IL-6水平更高，但差異無統計學意義。結果見圖2。

2.6對腫瘤相關酶活性指標的影響 結果見表3。與空白對照組比較，模型對照組Na+-K+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP 酶、SOD酶和GSH-Px酶活性均明顯下降(P<0.05)。加入他莫昔芬或不同劑量CUBα處理后，酶活性均有所恢復但均低于空白對照組，其中大劑量CUBα組小鼠Na+-K+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP 酶和GSH-Px與空白對照組差異無統計學意義，SOD活性水平仍明顯低于空白對照組(P<0.05)。與他莫昔芬組比較，大劑量CUBα對Ca2+- Mg2+-ATP 酶活性的保護作用更強，兩組差異有統計學意義(P<0.05)，Na+-K+-ATP酶、SOD酶和GSH-Px酶活性方面小劑量、中劑量CUBα組與他莫昔芬組差異無統計學意義。對荷瘤小組Na+-K+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP 酶、SOD酶和GSH-Px酶活性的保護作用，小劑量組、中劑量組、大劑量組呈劑量相關性，且大劑量組具有更強的酶活性保護作用。

①與空白對照組比較，t=3.275，6.492，P<0.05；②與模型對照組比較，t=2.740，P<0.05；③與他莫昔芬組比較，t=2.807～7.338，P<0.05。

①與空白對照組比較，t=2.935 2～6.239 0，P<0.05；②與模型對照組比較，t=2.174 3～5.412 0，P<0.05；③與他莫昔芬組比較，t=2.589 0～4.181 6，P<0.05。

2.7對腫瘤肺轉移的影響 結果見表4。空白對照組小鼠未見肺結節。他莫昔芬組平均結節數較模型對照組多2.6個，差異無統計學意義(P>0.05)。給予不同劑量CUBα后，小鼠肺轉移結節數均有所降低，且劑量越大，小鼠肺轉移結節數越少。其中，CUBα中劑量組、大劑量組與空白對照組和他莫昔芬組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 6組小鼠乳腺腫瘤肺轉移結節數統計結果

3 討論

DMBA誘導Balb/c小鼠建立乳腺腫瘤模型，屬較成熟的誘發性乳腺腫瘤模型，其腫瘤模型的形態學特性、內分泌影響和侵襲性特點與人類乳腺腫瘤相似，已廣泛用于腫瘤的病理生理及藥物分子機制等研究[10-11]。然而，不同動物對DMBA誘導乳腺癌的敏感性差異較大，發病率也不一致[12]。筆者在本研究采用改進劑量和給藥方式造模，給藥后8周小鼠出現明顯腫瘤體征，且激素水平、免疫器官及功能、腫瘤相關酶指標變化以及在他莫昔芬作用下的應答均與文獻報道一致，提示本研究建立的乳腺腫瘤小鼠模型可用于腫瘤藥物治療相關研究[8～11]。

CUBα是從葫蘆科雪膽屬塊莖中分離出的有效成分之一，既往研究[13]表明CUBα可通過破壞肌動蛋白細胞骨架而抑制細胞增殖，導致細胞周期阻滯而誘導腫瘤細胞凋亡[13-15]，從而阻止腫瘤的發生發展。本實驗研究發現，模型對照組小鼠在造模過程中逐漸出現自主活動明顯減少，踡縮少動、弓背毛松、畏寒喜暖、莫名寒戰等現象，造模14周后，模型對照組、CUBα 小劑量組體溫和體質量增長明顯低于空白對照組，模型對照組腫瘤增長迅速，腫瘤發生率100%。陽性藥物他莫昔芬治療后，瘤體生長明顯降低，CUBα中劑量組、大劑量組瘤體質量較模型對照組明顯降低，但較他莫昔芬組抑制程度略低，且CUBα小劑量組、中劑量組、大劑量組肺轉移結節數均低于模型對照組和他莫昔芬組，表明CUBα能改善模型小鼠腫瘤體征，抑制腫瘤生長，阻止腫瘤進展。

研究認為有絲分裂激酶Aurora A的抑制劑有明顯的抗乳腺腫瘤效果，尤其是在雌激素受體陽性乳腺腫瘤細胞中，能逆轉乳腺腫瘤細胞的耐藥性，提高對內分泌治療應答的的敏感性[10]。而近來對CUBα的研究[6]發現，其抑制人非小細胞肺癌A549細胞增殖的機制，很可能與其抑制Aurora A 磷酸化，進而誘導腫瘤細胞凋亡，阻滯細胞周期于G2/M期有關，提示CUBα作為潛在的Aurora A酶抑制劑，可能對乳腺腫瘤具有抑制作用。

乳腺癌是婦女常見的惡性腫瘤，其發病與遺傳、內分泌和環境等多種因素有關，尤其與性激素密切相關。徐紅等[16]研究認為血清中雌激素、孕激素水平增高可能是致乳腺纖維腺瘤、乳腺癌的直接原因。他莫昔芬是首個上市的抗雌激素受體的腫瘤內分泌治療藥物，用于乳腺癌、卵巢癌等腫瘤治療及預防等[17]。他莫昔芬可與雌激素受體競爭結合，形成受體復合體，從而阻止雌激素發揮作用，以抑制乳腺癌細胞的增殖或減少腫瘤發生。本實驗結果顯示， 相較于模型對照組，給予他莫昔芬后，雌二醇和孕酮水平均明顯降低，而給予CUBα雖能降低雌二醇和孕酮水平，但3個劑量組均無統計學意義，提示CUBα對腫瘤作用的機制可能與他莫昔芬不同。

在腫瘤的發生過程中，核因子κB ( nuclear factor，NF-κB)和信號傳導蛋白和轉錄激活物(signal transducersand activators of transcription 3，STAT3) 可能是調控腫瘤炎性微環境核心分子，并在多種腫瘤中檢測到NF-κB和STAT3的共激活[18]。研究發現，IL-1、TNF-α等炎癥因子可通過上調NF-кB活性促進 IL-6分泌，間接活化STAT3，從而通過介導炎癥遞質的細胞外信號調控腫瘤細胞、免疫細胞等的生物學行為，促進腫瘤發生及腫瘤相關性炎癥的形成[15]。本實驗結果顯示，相較于模型對照組，小鼠給予不同劑量CUBα后，TNF-α和IL-6水平均下降并呈療效相關性，中劑量和大劑量CUBα組TNF-α和IL-6均明顯低于他莫昔芬組，提示CUBα可能參與抑制炎癥相關因子的形成，抑制腫瘤炎癥微環境進而抑制腫瘤發生發展。進一步研究發現，給予不同劑量CUBα后，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性水平明顯提高，并具療效關系，可能與其具有較強的保護細胞膜、改善細胞穩定性作用有關。

在本研究的12.5～50 mg·kg-1劑量范圍內，CUBα能改善模型小鼠腫瘤體征，抑制腫瘤生長，降低雌二醇和孕酮水平，保護SOD、GSH-Px酶活性及減少肺轉移。尤其在對改善白細胞計數及脾、胸腺指數、TNF-α和IL-6水平等免疫相關指標的影響上，作用明顯且具較明顯的量效關系，提示CUBα對DMBA小鼠腫瘤的抑制作用可能與其保護抗炎[5]、保護免疫系統和調節免疫功能有關。進一步研究發現，CUBα劑量相關性提升血液紅細胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性水平，并且中劑量、大劑量效果明顯強于5 mg·kg-1他莫昔芬，提示CUBα對腫瘤作用的機制與他莫昔芬不同，可能與其具有較強的保護細胞膜、改善細胞穩定性作用有關，但該現象是否與其調節免疫進而抑制腫瘤的藥理作用關聯，以及其分子機制如何，尚待進一步研究。