新型鴨呼腸孤病毒TaqMan 探針實時熒光定量 RT-PCR 檢測方法的建立與應用

張 博,陳立功,2，武 華，陰雅潔，孟利佳，郭康康，侯紹華，董世山,2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河北 保定 071001；2.河北省獸醫(yī)生物技術創(chuàng)新中心 河北 保定071001； 3.中國農(nóng)業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

新型鴨呼腸孤病毒病是由新型鴨呼腸孤病毒引起的一種急性傳染病，可感染番鴨、半番鴨、麻鴨、北京鴨、櫻桃谷鴨、綠頭野鴨和鵝等水禽［1-3］，發(fā)病鴨臨床表現(xiàn)為聚集扎堆、不愿進食、腹瀉、部分雛鴨表現(xiàn)運動障礙，外觀發(fā)病鴨眼周圍有明顯淚痕［4］；剖檢發(fā)病鴨常見肝臟明顯腫大，伴有不同程度的針尖狀壞死點，斑塊狀的瘀血、出血，壞死灶與周圍健康組織界限明顯［5］。近幾年NDRV 病已經(jīng)嚴重危害養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展［6］，目前預防本病的關鍵是做好養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理，改善鴨場飼養(yǎng)環(huán)境，保持良好的光照和通風，做好防寒保溫工作，在該病的流行地區(qū)應考慮接種疫苗［7］。

NDRV 屬于呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬，為分節(jié)段的雙股RNA 病毒，基因組長度大約 23 000 bp，G+C 含量大約為51.41%。NDRV 分為10 個RNA 片段，即3個大基因L1 ～L3，3個中基 因M1 ～M3；4 個 小 基 因S1 ～S4，除S1 基因片段外，L1 ～S4 所有基因片段均具有保守的末端序列，各編碼一種蛋白［8］。3 個大基因節(jié)段L1 ～L3，分 別 編 碼λA、λB 和λC3 種 蛋 白；3 個中基因節(jié)段M1 ～M3，分別編碼μA、μB 和μNS 3 種蛋白；4 個小基因節(jié)段中的S1 基因片段為三順反子，編碼P10、P18 和σC 蛋白；S2、S3 和S4 分別編碼σA、σB 和σC 蛋白，但番鴨禽呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus, MDRV)的S4 片段是雙順反子基因，編碼P10 和σC 蛋白［9-10］。NDRV 的S3基因與MDRV 和禽呼腸孤病毒(Avian reovirus, ARV) 的S3 基因的分子特征有很大區(qū)別［11-12］，可以根據(jù)S3 基因差異性進行分類。本研究參照GenBank 中的NDRV σB（登錄號為MK749405.1）基因序列設計1對特異性擴增引物，建立了1 種TaqMan 熒光定量RT-PCR 檢測方法，可為NDRV 的檢測提供快速、準確的方法。……