基于UPLC-MS/MS的蒽貝素血藥濃度測定及其在大鼠體內藥動學研究*

柴 玲，劉布鳴**，徐遠金，李青倩，韋寶偉，黃 艷

(1.廣西中醫藥研究院，廣西中藥質量標準研究重點實驗室，廣西南寧 530022；2.廣西大學，廣西南寧 530004)

0 引言

蒽貝素(Embelin)又稱酸藤子酚，為苯醌類化合物2, 5-二羥基-3-十一烴-2, 5-環己二烯-1, 4二酮(2, 5-dihydroxy-3-undecyl-2, 5-cyclohexadiene-1,4-dione)[1]，是酸藤子屬植物的主要有效成分之一。從酸藤子Embelialaeta果實中分離得到蒽貝素并純化制成中藥化學對照品[1-2]，目前對蒽貝素活性研究表明其具有驅蟲[3]、抗氧化自由基[4]、降血糖[5]、保護胰島細胞[6]、治療心臟病[7]和精神障礙[8]等作用，還能抑制癌細胞增殖和誘導其凋亡[9-10]。但是蒽貝素在體內血藥濃度及其藥動學未見研究報道。超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)技術具有靈敏度高、檢出限低、樣品用量少的優點，廣泛用于化學成分[11]、藥物代謝[12]、雜質鑒定[13]等藥物分析中。本研究建立測定大鼠血漿中蒽貝素濃度的超高效液相色譜串聯質譜法，并研究蒽貝素血藥濃度及藥動學規律，為其臨床藥學基礎研究提供科學實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國，Agilent公司)，Agilent 6460 Triple Quad質譜檢測器(美國，Agilent公司)，Synthesis A10TM超純水系統(美國，Millipore公司)，ME235S電子天平(德國，Sartorius公司)，KQ2200DV型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，5810R真空濃縮儀(德國，Eppendorf公司)。

1.2 藥品與試劑

蒽貝素對照品(純度≥98%)由本課題組制備[1-2](EBS-20140728)。內標物大黃素(純度≥98%)購自四川省維克奇生物科技有限公司(wkq-00148)。色譜甲醇、乙腈購自美國Fisher公司。分析純乙醇、氨水、乙酸乙酯購自廣東光華科技股份有限公司。色譜純甲酸購自美國Merck KGaA公司。實驗用水為超純水。

1.3 動物

Sprague-Dawley (SD)大鼠12只(隨機分組，不分雌雄)，體質量為(280±20) g，購自廣西醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK(廣西)2009-0002。

1.4 測定條件

色譜條件：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)；流動相：0.1%氨水(A)-甲醇(B)；梯度洗脫：0.0—4.0 min，10%→100% B；4.0—8.0 min，100% B；流速：0.3 mL/min；進樣量:1 μL；柱溫25℃。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，負離子模式檢測，多反應監測(MRM)。

毛細管正(ESI+)、負(ESI-)離子電壓分別為4 000 V和3 000 V。干燥氣和鞘氣均為N2，溫度分別為300℃和360℃，流速分別為10 L/min和12 L/min。霧化氣為N2，壓力為2.8×105Pa。蒽貝素和內標物大黃素的質譜分析參數：蒽貝素母離子293.1，二級碎片子離子96.6，源內碎裂電壓190 V，碰撞能量25 eV；大黃素母離子269.0，二級碎片子離子225.1，源內碎裂電壓135 V，碰撞能量32 eV。

1.5 溶液的配制

1.5.1 蒽貝素標準溶液

精密稱取蒽貝素對照品10 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質量濃度為1.0 mg/mL的對照品貯備液。取上述對照品貯備液適量，用甲醇進一步稀釋，制成質量濃度分別為制備10，50，150，300，500，750，1 000，1 200 ng/mL的蒽貝素系列標準溶液，置于4℃下密封保存，備用。

1.5.2 內標溶液

精密稱取大黃素對照品10 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質量濃度為1.0 mg/mL的內標貯備液，置于4℃下保存，使用前用甲醇稀釋至所需濃度。

1.5.3 蒽貝素藥液

精密稱取羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 0.50 g，加超純水100 mL，加熱攪拌使其溶解，超聲振蕩3 h，靜置過夜制成0.5% CMC-Na水溶液。精密稱取蒽貝素4.2 mg，加入5 mL 0.5% CMC-Na水溶液中，搖勻形成均勻懸濁液。

1.6 血漿樣品處理

取血漿樣品100 μL，加入500 μg/mL大黃素20 μL、丙酮200 μL和乙酸乙酯200 μL，將混合物渦旋混合1 min，在4℃、轉速1.2×104r/min條件下離心20 min，取上清液通過濃縮儀蒸發溶劑至干燥，殘渣加入甲醇100 μL復溶，超聲振蕩10 min后再次離心20 min，取上清液用0.22 μm濾膜濾過，取濾液1 μL，進樣分析。

1.7 方法學考察

1.7.1 專屬性

取空白血漿、加入蒽貝素和內標物的空白血漿及大鼠灌胃給藥蒽貝素1.5 h后的血漿，按1.6節的方法處理后，再按1.4節的色譜條件進樣分析。

1.7.2 線性關系和檢出限

取空白血漿 200 μL，依次加入蒽貝素系列標準溶液，制備10，50，150，300，500，750，1 000，1 200 ng/mL蒽貝素血漿樣品。按1.6節的方法處理后，再按1.4節的色譜條件進樣分析。以待測物質量濃度(x，ng/mL)為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值(y)為縱坐標進行線性回歸，使用加權因子(w=1/x2)最小二乘法計算標準曲線方程。

1.7.3 精密度和準確度

1.7.4 回收率和基質效應

按1.7.2節的方法分別配制低、中、高質量濃度的質控樣品各6份，按1.6節的方法處理后，再按1.4節的色譜條件進樣分析，記錄蒽貝素與內標的峰面積比值(R1)；精密量取空白血漿適量，共6份，按1.6節的方法處理后，加入相應質量濃度的蒽貝素標準溶液，使最終質量濃度與上述質控樣品對應，以氮氣流吹干，殘渣用甲醇100 μL復溶，渦旋1 min后，1.2×104r/min離心20 min，取上清液濾過后，進樣分析，記錄蒽貝素與內標物的峰面積比值(R2)。提取回收率=(R1/R2)×100%。

1.7.5 穩定性

按1.7.2節的方法配制低、中、高質量濃度的質控樣品各6份，分別于4℃儲存24 h，-20℃儲存20 d和凍融循環3次后，按1.6節的方法處理，再按1.4節的色譜條件進樣分析，考察上述樣品的穩定性。

1.8 藥動學實驗

隨著我國油氣產業的發展，剩余資源中“邊、低、難”資源的占比越來越大，因此油氣田開發的難度將進一步加大，一些深井、超深井已納入必將實現的目標。套管作為連接地面和油氣生產層的重要通道，其質量好壞直接影響著鉆井安全和油氣井的使用壽命[1]。在超深井下套管過程中，由于套管尺寸比較大，固封段長，所以井口的載荷大，給下套管作業帶來了許多難題。因此必須采取相應的技術措施來保障下套管的順利進行。

2 結果與分析

2.1 方法學考察結果

蒽貝素與內標物的保留時間分別為3.6 min和2.9 min，能夠完全分離，峰形好，血漿中內源性物質不干擾蒽貝素和內標物的測定(圖1)。蒽貝素血藥濃度的線性范圍為10—1 200 ng/mL，定量下限為10 ng/mL(信噪比為10∶1)，以信噪比3∶1測得最低檢測限為3 ng/mL。蒽貝素標準曲線回歸方程為y=3.5816×10-4x+0.4869(r=0.999 0)。精密度和準確度試驗結果見表1,提取回收率和基質效應試驗結果見表2,穩定性試驗結果見表3。

A.空白血漿; B.空白血漿+蒽貝素+大黃素; C.大鼠灌胃給藥后1.5 h 的血漿樣品；Ⅰ.蒽貝素,Ⅱ.大黃素

2.2 藥動學研究

由圖2可知，大鼠灌胃給藥蒽貝素后的藥-時曲線符合二室模型。通過計算得到蒽貝素在大鼠體內的主要藥動學參數，分別是分布半衰期(t1/2α)為(12.60±1.19) h、消除半衰期(t1/2β)為(15.95±0.73) h、表關分布容積(V)為(0.001±0.00) L/g、清除率(CL)為(0.001±0.00)、AUC0-∞為(3 717.48±269.82) ng·h/mL、AUC0-t為(3 596.31±271.93) ng·h/mL、藥物從中央室消除的一級速率常數(K10)為(0.05±0.00) h、藥物從中央室向周邊室運轉的一級速率常數(K12)為(0.01±0.00) h、藥物從周邊室向中央室轉運的一級速率常數(K21)為(0.05±0.01) h。蒽貝素灌胃給藥后在體內吸收較快，血藥濃度在0.15 h達到最大值，蒽貝素的t1/2β值較大，說明其在體內消除速度緩慢。蒽貝素的藥時曲線不規則，存在3個峰，可能是肝腸吸收、胃腸吸收、雙部位吸收等原因導致的。

表1 精密度和準確度試驗結果(n=6)

表2 提取回收率和基質效應試驗結果(n=6)

圖2 蒽貝素在大鼠體內的平均藥-時曲線

表3 穩定性試驗結果(n=6)

2.3 測定方法優化

2.3.1 內標物的選擇

分別以大黃酸、大黃酚、大黃素和大豆苷元作為內標物進行試驗，結果發現大黃素與蒽貝素結構相似，保留時間相近，無內源性干擾(圖3)。因此采用大黃素作為內標物。

圖3 血漿中不同內標物的提取回收率

2.3.2 色譜條件的優化

分別以甲醇-水和乙腈-水作為流動相進行分離效果試驗，結果甲醇-水體系作流動相時蒽貝素與內標物的分離效果較好。為提高蒽貝素離子化強度，對不同體積分數的氨水溶液0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%進行試驗，結果采用0.10%氨水-甲醇作流動相時，蒽貝素靈敏度最高(圖4)。因此采用0.10%氨水-甲醇為流動相。

圖4 流動相中氨水濃度對蒽貝素峰面積的影響

2.3.3 質譜條件的優化

2.3.4 血漿樣品處理條件的優化

分別對不同蛋白沉淀劑(乙腈、乙醇和甲醇)和液液萃取劑(氯仿、丙酮和乙酸乙酯)的提取效率進行試驗。結果采用丙酮和乙酸乙酯處理樣品的提取效率較高(圖5)。對不同比例的丙酮和乙酸乙酯(1∶0，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，0∶1，V∶V)的提取效率進行試驗，結果體積比為1∶1的丙酮和乙酸乙酯作萃取劑效果最好(圖6)。此外，還對不同體積的丙酮-乙酸乙酯(300，400，500，600，700，800 μL)對提取效率的影響進行試驗。結果表明，采用400 μL丙酮-乙酸乙酯對血漿進行萃取的提取效率最高(圖7)。因此采用200 μL丙酮和200 μL乙酸乙酯作萃取劑。

圖5 不同沉淀試劑對血漿中分析物的提取回收率

圖6 不同比例丙酮-乙酸乙酯對血漿中分析物的提取回收率

圖7 不同體積丙酮-乙酸乙酯對血漿中分析物的提取回收率

3 結論

本文建立了一種以大黃素為內標物，測定大鼠血漿中蒽貝素的超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)分析方法，該方法簡單、快速、準確、選擇性強。并對大鼠口服蒽貝素給藥血藥濃度和藥動學進行試驗。研究表明，大鼠灌胃給藥蒽貝素后的藥-時曲線符合二室模型，蒽貝素口服灌胃給藥后在體內吸收較快，血藥濃度在0.15 h達到最大，t1/2β值較大，說明蒽貝素在體內消除速度緩慢。該研究結果為蒽貝素在生物體內的有效性及安全性評價提供了實驗依據，為今后測定蒽貝素的生物功效及臨床藥學研究奠定基礎。