不同來源的黃芪多糖產品質量比較研究*

蔣小華，林 楠，劉冬敏，李典鵬，盧鳳來**

(1.廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所，廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室，廣西桂林 541006； 2.桂林華藝生物科技有限公司，廣西桂林 541805)

0 引言

黃芪為豆科植物膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus)或蒙古黃芪(A.membranaceusvar.mongholicus)的干燥根，黃芪多糖為黃芪的主要活性成分，臨床常用作免疫增強劑，抗細菌、抗病毒藥物[1-2]。隨著集約化養殖業的發展，畜禽應激性增加，免疫力持續下降，發病率逐年攀升。自2006 年豬高熱病爆發以來，黃芪多糖成為“明星藥物”，在市場上供不應求，造成目前市場上黃芪多糖產品繁多、價格各異、質量參差不齊，存在摻假和以次充好等現象。

黃芪多糖常用的鑒別方法有物理方法(顏色、手感、味道和溶解情況)和化學方法[3-4](醇沉淀法、高熱法和高效薄層色譜儀鑒別法)，這些方法只能大致鑒別，不能確定產品的品質。目前常用于測定黃芪多糖含量的方法為紫外分光光度法[5-6]。該方法以葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸顯色法測定總多糖含量，因此不能辨別是否含有葡萄糖、麥芽糊精。多糖由各種單糖組成，來自同一植物資源的多糖其單糖組成及構成比例在一定范圍內波動，通過對單糖的檢測可對藥材及產品進行鑒別。目前已有學者采用柱前衍生化高效液相色譜法和乙酰化氣相色譜法等[7-11]，對不同來源黃芪多糖的單糖成分進行分析。然而這些方法都需要衍生化處理才可以分析，前處理煩瑣，還可能引入雜質，干擾測定結果。

示差折光檢測器是一種高度穩定、靈敏的通用型檢測器。現行測定單糖的國家標準GB/T 22221—2008 和GB/T 22222—2008 采用的就是高效液相色譜示差折光法[12]。采用該方法檢測黃芪多糖的研究報道較少，且未見不同廠家黃芪多糖的質量評價。為評價不同來源黃芪多糖產品的優劣，給消費者提供科學評價方法與依據，本研究應用高效液相色譜示差折光法測定黃芪多糖的組成與構成，同時應用紫外分光光度法、物理鑒別對多個黃芪多糖產品進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

從不同來源獲取9批黃芪多糖產品(A—I)，所有產品均為粉末狀。其中，產品A、B、E來自桂林華藝生物科技有限公司，產品C、D為桂林華藝生物科技有限公司從別的廠家收集得到，產品F-I為從淘寶網上采購(產品H產地為河北石家莊，產品F、G和I均產自河南省)。葡萄糖和阿拉伯糖標準品為本實驗室自制，純度99.9%；其他試劑均為國產分析純。實驗用水全部采用超純水。

1.2 儀器設備

T6型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；日本島津高效液相色譜儀LC-20AT，包括RID-10A示差檢測器、控制器CBM-20A、在線脫氣器DGU-20A5、泵LC-20AT和手動進樣器7255；柱溫箱(Millipore公司)；Transgenomic Ca2+分析柱(300 mm×6.5 mm)；50 L YXQ-LS-SII立式滅菌鍋(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；電子天平(梅特勒AT-200)；臺式離心機(珠海黑馬醫學儀器有限公司)；B3500S-MT超聲清洗器(上海必能信超聲有限公司)；DDS-11A雷磁電導率儀(上海儀電科學儀器股份有限公司)；HH-S數顯恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司)；超純水儀(Millipore 公司)。

1.3 方法

1.3.1 紫外分光光度法(UV)[5-6]

1.3.1.1 對照溶液的制備

準確稱取在105℃干燥至恒重的無水葡萄糖500 mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL葡萄糖溶液置于100 mL量瓶中，加水至刻度，即得。

1.3.1.2 供試品溶液制備

準確稱取黃芪多糖粉末1.000 g置于250 mL量瓶中，加20 mL水溶解，再加入30%硫酸鋅溶液5 mL，水浴加熱5 min 后，在振搖下加入亞鐵氰化鉀試液5 mL，冷卻后加水至刻度，搖勻，濾過，棄初濾液，取續濾液5 mL置于200 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

1.3.1.3 含量測定

準確量取對照品溶液與供試品溶液各2 mL，分別置于10 mL 量瓶中，各加入2%苯酚溶液0.5 mL，硫酸5 mL，搖勻，水浴加熱30 min，冷卻，加水稀釋至刻度，搖勻，采用紫外分光光度法在490 nm 處分別測定吸收值，以葡萄糖濃度為x軸，吸光值為y軸，繪制標準回歸曲線，并根據標準回歸曲線進行回歸分析，計算樣品含量。

1.3.1.4 精密度、回收率和穩定性試驗

精密度：取同一濃度葡萄糖標準品1 d內重復測定6次，計算葡萄糖日內RSD。

回收率：將不同濃度的葡萄糖標準品加入6份樣品中，測定平均回收率，計算RSD。

穩定性：取3種不同濃度的無水葡萄糖溶液，分別水浴加熱0，5，10，20，30 min，在490 nm 處分別測定吸收值。

1.3.2 黃芪多糖的物理鑒別法

分別稱取9批黃芪多糖供試品1.0 g，置于100 mL玻璃三角瓶中，觀察它們的顏色和粒度，看是否有白色顆粒；放置30 min后，搖晃三角瓶觀察是否有掛壁現象；加入25 mL 18 g/L稀硫酸溶液溶解，觀察溶解情況，搖晃三角瓶，觀察是否有泡沫產生。水解后搖勻，取1.5 mL水解液10 000 r/min離心5 min，觀察沉淀量。

1.3.3 高效液相色譜(HPLC)法

1.3.3.1 黃芪多糖的水解

參照文獻[13]的方法并適當改進，精密稱取黃芪多糖產品粉末1.0 g置于100 mL三角瓶中，加入25 mL 18 g/L H2SO4溶液，于超聲清洗器中均勻分散，蓋上橡膠塞，置于立式滅菌鍋內121℃水解90 min。放冷，水解結束后補足蒸發的水分。過濾除去溶液中的不溶物，取0.5 mL水解液，先加入4 mL水稀釋，再加1.5 mL 左右0.1 mol/L NaOH溶液調pH為中性，最后定容至10 mL；加入混合樹脂1.2 g (m陰離子樹脂∶m陽離子樹脂=2∶1)和少量活性炭，放搖床上，脫鹽后電導儀檢測電導降至5 μs/cm 以下時，用0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.3.3.2 HPLC測定條件

島津高效液相色譜儀器、LC solution色譜工作站、色譜柱Transgenomic Ca2+、RID-10A示差檢測器，流動相為超純水，流速0.5 mL/min，柱溫85℃，進樣量20 μL。

1.3.3.3 標準曲線的繪制

取6個不同濃度的葡萄糖和阿拉伯糖混合標準品溶液，按照HPLC條件進行測定，以加入標準溶液濃度為橫坐標x，以相應單糖峰面積為縱坐標y，繪制標準曲線。根據信噪比確定檢出限(RSN=3)和定量限(RSN=10)。

1.3.3.4 精密度、回收率和穩定性試驗

精密度：取同一濃度葡萄糖和阿拉伯糖標準品1 d內重復測定6次，分別計算其日內RSD。

回收率：分別取葡萄糖、阿拉伯糖加水配制成不同濃度的標準品，再分別加入6份黃芪多糖樣品中，測定平均回收率，計算RSD。

穩定性：取同一批黃芪多糖樣品，分別水解0，1，2，4，8，24 h后，測定葡萄糖和阿拉伯糖的濃度，計算RSD。

1.3.3.5 樣品測定

分別適量取7家企業生產的9批黃芪多糖產品，按1.3.3.1節的方法水解后處理制成供試品溶液，按照HPLC條件進行含量測定，與單糖標準品進行比對，分析樣品水解產物，并根據標準曲線計算黃芪多糖樣品水解后葡萄糖和阿拉伯糖的濃度。

2 結果與分析

2.1 黃芪多糖產品總多糖含量

2.1.1 標準曲線、精密度、回收率和穩定性試驗

研究結果顯示，葡萄糖標準回歸曲線為y=

0.2122x-0.00612，R2=0.998 0，濃度區間為0.05—1.50 g/L，表明線性關系較好。葡萄糖日內RSD為0.72% (n=6) ，說明該方法的精密度良好；平均回收率為99.20%，RSD為0.55%，表明該方法的回收率符合要求；顯色反應時間在30 min內時，溶液吸收度無明顯變化，穩定性較好。

2.1.2 樣品含量測定

對9批產品中黃芪總多糖進行含量測定，結果如表1所示，9批黃芪多糖產品的總多糖含量差別均比較大，有5批產品總多糖含量達到0.600 0 g/g以上，其中產品C、H的總多糖含量超過0.900 0 g/g，而另外4個產品總多糖含量較低，為0.100 0—0.300 0 g/g。

表1 9批黃芪多糖產品總多糖含量

2.2 黃芪多糖的性狀

圖1中(a)為9批黃芪多糖產品粉末外觀，(b)為9批產品溶解在稀硫酸中的產泡情況，(c)為9批產品水解離心后的情況。由圖1及表2可以看出，9批黃芪多糖產品顏色差別比較大，顏色較淺的有產品A、B、E，產品F和G的顏色最深，為紅褐色。各產品搖晃后，大部分有掛壁現象，只有產品D和I沒有。從溶解情況來看，產品C溶解速度最快，溶解最好，溶液透亮，離心后沒有沉淀；產品D最難溶，有大量的不溶物，離心后沉淀量也最多。從產泡情況來看各產品也有很大的差別，有的產品搖晃后無泡，如產品C和H；有的有少量泡沫，如產品D—G、I；產泡沫量最大的是產品A和B。

圖1 9批黃芪多糖產品的外觀、溶解后產泡及水解液情況

表2 9批黃芪多糖產品性狀

2.3 黃芪多糖單糖組成

2.3.1 標準曲線、線性范圍和檢出限測定結果

葡萄糖標準曲線為y= 273649x+377.87，R2=1，濃度區間為0—2.0 g/L；葡萄糖的檢出限為0.003 1 g/g，定量限為0.009 3 g/g。阿拉伯糖標準曲線為y=303410x-15.929，R2=1，濃度區間為0.0—0.5 g/L，檢出限為0.002 1 g/g，定量限為0.006 3 g/g。

2.3.2 精密度、回收率、穩定性試驗

葡萄糖和阿拉伯糖日內RSD分別為0.67%(n=6)、0.93%(n=6)，表明儀器精密度良好；葡萄糖和阿拉伯糖的平均回收率分別為99.28%、99.10%，RSD均小于1.00%，表明該方法的回收率符合要求；葡萄糖和阿拉伯糖峰面積RSD分別為1.86%、1.95%，說明樣品溶液在24 h穩定。

2.3.3 9批黃芪多糖樣品中葡萄糖和阿拉伯糖的含量

通過與單糖標準品進行比對，可確定黃芪多糖水解后主要含有葡萄糖和阿拉伯糖(圖2)。從表3可以看出，黃芪多糖水解后各單糖含量有很大差別。產品A、B、E水解后的葡萄糖含量為0.36—0.40 g/g，產品C和H葡萄糖含量大于0.60 g/g；其他產品的葡萄糖含量很低，小于0.1 g/g。這個結果與紫外分光光度檢測結果相吻合：總多糖含量高的，則水解后葡萄糖單糖含量也相應地高。同時，樣品中葡萄糖和阿拉伯糖含量比例有很大的差別。產品A、B、E的峰面積比分別為5.70∶1，5.28∶1，5.71∶1；在產品C和H中，水解后的葡萄糖與阿拉伯糖的峰高相差較大，葡萄糖含量很高，而阿拉伯糖含量相對較少，兩者的峰面積比在15∶1左右；在產品D、F、G和I中，檢測到葡萄糖和阿拉伯糖的峰都很小，所含葡萄糖的量很少，兩者的峰面積比為(3.34—1.75)∶1。

1:葡萄糖Glucose 2:阿拉伯糖Arabinose

表3 9批黃芪多糖產品水解后各單糖含量，葡萄糖與阿拉伯糖峰面積比

3 討論

3.1 黃芪多糖產品外觀性狀的比較

李桂菊[3]和杜繼紅等[4]認為：黃芪多糖外觀一般為淺黃色和淺棕色，純度較高的呈淡黃白色；具有吸濕性和掛壁現象，可溶解于水中，但溶解速度較慢，溶解后會產生泡沫。而質量差的黃芪多糖顏色較深，溶解性不好，有很多沉淀，產泡較少。此外，黃芪多糖產品如果加入葡萄糖復合物、麥芽糖糊精復合物等會出現溶解速度加快的現象[3]。本實驗通過對黃芪多糖產品外觀性狀的比較發現，產品A、B為淡黃色，產品E為類白色，具有吸濕性和掛壁現象，溶解后產生氣泡，沉淀較少。產品C為黃褐色，最容易溶解且無氣泡產生。產品D、F、G和I則呈顏色較深、難溶解、沉淀多、氣泡少的特點。僅從外觀判斷，產品A、B、E這3個批次質量較好，其余批次質量較差。此方法簡便，但無法判斷產品的純度。

3.2 紫外分光光度法分析黃芪多糖產品

李桂菊[3]認為，黃芪多糖以葡萄糖計，口服液級應不低于65%，針用級應不低于70%。而杜繼紅等[4]認為，就目前最佳技術條件而言，動物保健品行業中唯一取得黃芪多糖新藥證書的產品——黃芪多糖粉中多糖含量不超過70%，市場上出現的含量80%—98%的黃芪多糖產品基本是在黃芪多糖里面加葡萄糖的假冒偽劣產品。本研究通過紫外分光光度法檢測總多糖含量，發現產品A、B、C、E和H的總多糖含量大于60%，其中產品C和H的總多糖含量大于90%，其余產品的總多糖含量為14%—29%。紫外分光光度法是以葡萄糖為對照品進行含量測定，可以判斷質量較差的產品(如產品D、F、G和I總多糖含量低于30%)，但是無法對摻假(加入葡萄糖和麥芽糖)的產品進行鑒別。因此，僅僅從外觀性狀和紫外分光光度法測總多糖含量鑒別黃芪產品的質量顯然不夠全面。

3.3 HPLC示差法測定黃芪多糖產品

黃芪多糖是從黃芪中提取出來的，由于黃芪品種、產地不同，黃芪多糖的單糖組成和比例都有差別。陳虎虎等[11]用柱前衍生化-高效液相色譜法測定蒙古黃芪多糖中單糖的組成，發現其水解后主要有阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖，含量比分別為1∶0.94∶5.56。王趙等[14]對注射用黃芪多糖單糖組分進行分析，發現其單糖主要由阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖組成，峰面積比為1∶0.429∶8.430。HPLC示差法不需要衍生化，水解處理后就可以分析單糖的組成。本研究通過測定發現黃芪多糖的單糖主要組成是阿拉伯糖和葡萄糖，其中產品A、B和E中，阿拉伯糖和葡萄糖的峰面積比接近1∶5，這些產品的單糖組成與文獻結果[11,14]相近。姚丹等[7]用氣相色譜分析黃芪多糖單糖組分，測定阿拉伯糖-果糖-葡萄糖-甘露糖的摩爾構成比例為1.00∶10.30∶24.60∶0.46，本研究產品C和H的測定結果接近這個比值。而產品D、F、G和I的阿拉伯糖和葡萄糖峰面積比為1∶(1.75—3.34)，與文獻[7,11,14]報道的結果相差較遠。

4 結論

本研究采用紫外分光光度法測定各批次黃芪多糖總多糖含量，用物理方法觀察黃芪外觀性狀，用高效液相色譜示差折光法分析黃芪多糖的單糖組成及含量，同時對黃芪多糖產品進行鑒定，能客觀準確地反映出產品的質量。通過對9批黃芪多糖產品的檢測后認為：黃芪多糖產品中，顏色較淺、溶解速度慢、可產大量的泡沫、總多糖含量為0.60—0.75 g/g、單糖的主要成分是葡萄糖和阿拉伯糖、峰面積比為(4—7)∶1的產品，是質量比較優的產品，如產品A、B和E。總多糖含量很高(大于0.90 g/g)、溶解速度很快、產泡不多、葡萄糖與阿拉伯糖的峰面積比偏大(15∶1)的產品，則摻入了葡萄糖復合物等其他東西，產品質量不太好，如C和H產品。對于那些顏色深、起泡少、總多糖和單糖含量都很低的產品，其質量很差，如產品D、F、G和I。本方法簡便、快速，且更全面地評價了各黃芪多糖產品的質量，可為鑒別黃芪多糖產品品質提供參考。