疊鞘石斛葉黃酮類成分的“點-線-面”質量分析*

阮沛樺，鄧紅，2，傅詠梅，張蜀，2，郭彩娥，林俊強，李志超

(1.廣東藥科大學廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣州 510006；2.廣東藥科大學/廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心，廣州 510006；3.國藥集團廣東環球制藥有限公司，佛山 528000；4.廣東省清遠市中醫院/廣東省鮮藥和民族醫藥工程技術研究中心，清遠 511500)

疊鞘石斛[DendrobiumaurantiacumRchb.var.Denneanum( Kerr.) Z.H.Tsi.]被收載于2010年版《四川省中藥材標準》[1]，是蘭科植物疊鞘石斛栽培品的新鮮或干燥莖，是四川省著名道地藥材嘉定石斛的主要品種，具地方特色，是我國國家地理標志產品，且在廣東、廣西、貴州、云南等地常作為石斛藥材臨床使用[2-3]。疊鞘石斛臨床上有滋陰除熱、養胃生津之功效，入選國家石斛林木種質資源庫，但其生長環境特殊，生長緩慢，生長期長，繁育系數低，資源一旦被破壞將難以恢復[4]。近年來，隨著對石斛研究的深入，發現石斛中除多糖外[5]，黃酮類成分也是其另一重要活性部位，主要分布于葉內[6]。國內外研究仍主要集中在石斛莖的多糖成分上，葉的研究基礎相對薄弱。文獻報道石斛黃酮藥理作用明顯，尤其是其具有突出的抗氧化能力[7-11]。疊鞘石斛葉含黃酮類成分較高，對其進行研究開發具有廣闊的前景，也有利于中藥資源的綜合利用與整合。筆者在本實驗采用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)-二極管陣列檢測器(photo diode array，PDA)法建立10批疊鞘石斛葉指紋圖譜，并進行分析比較，同時測定葉中芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁、總黃酮含量，由單成分的“點”、多成分的“線”，到指紋圖譜全成分的“面”，以期為疊鞘石斛葉含量控制提供依據，為黃酮類成分的含量測定提供新思路。

1 儀器與試藥

1.1儀器 AcQuity UPLC，配置PDA(美國Waters公司)；BSA224S-CW型電子分析天平(賽多利斯儀器北京有限公司，感量：0.1 mg)、CP2250型電子分析天平(賽多利斯儀器北京有限公司，感量：0.01 mg)；UV-1800紫外-可見分光光度儀(日本島津公司)；HK3300H超聲波清洗儀(上海科導超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷對照品(含量：99.9%，批號：F0940192)、異夏佛塔苷對照品(含量：98.7%，批號：F0930336)均購自中山市成諾生物科技有限公司；蘆丁對照品(純度：97.5%，批號：110842-201709)購自中國食品藥品檢定研究院。疊鞘石斛葉[批次S1～S10(生長年份)分別為云南181105(一年生)、云南190520(兩年生)、四川19041101(一年生)、四川19041102(一年生)、四川19041103(兩年生)、四川19041104(兩年生)、四川19041105(兩年生)、四川19041106(三年生)、四川19041107(四年生)、四川19041108(四年生)]，均由云南省文山壯族苗族自治州麻栗坡態合堂野生石斛保育有限公司提供，經由廣東藥科大學/廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心中藥室何偉教授鑒定為正品。乙腈、甲醇、四氫呋喃、磷酸為色譜純。其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1三種單一成分及總黃酮成分含量測定方法

2.1.1色譜條件 AcQuity UPLC HSS T3 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；體積流量：0.3 mL·min-1；檢測波長：337 nm；柱溫：30 ℃；進樣體積：2 μL；流動相A為四氫呋喃-乙腈-甲醇(10：22：5)；流動相B為0.05%磷酸溶液，梯度洗脫(0～9 min，9%→10%A；9～10 min，10%→11%A；10～12 min，11%→11.5%A；12～13 min，11.5%→14.5%A；13～20 min，14.5%→15%A；20～25 min，15%A；25～60 min，15%→30%A；60～65 min，30%→9%A)。

2.1.2對照品溶液的制備

2.1.2.1芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷對照品儲備液 精密稱取芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷10.00 mg，置10 mL量瓶，加甲醇制成每毫升含對照品1.000 mg的溶液。

2.1.2.2異夏佛塔苷對照品儲備液 精密稱取異夏佛塔苷9.94 mg，置20 mL量瓶，加甲醇制成每毫升含對照品0.497 mg溶液。

2.1.2.3蘆丁對照品儲備液 精密稱取蘆丁9.96 mg，置20 mL量瓶，加甲醇制成每毫升含對照品0.498 mg溶液。

2.1.2.4混合對照品溶液 取芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁對照品儲備液適量，加甲醇制成每毫升約含各對照品100 μg的溶液。

2.1.3供試品溶液的制備 精密稱取疊鞘石斛葉粉末0.1 g[過三號篩，篩孔內徑(355±13) μm)]，置25 mL具塞錐形瓶，精密加入70%甲醇10 mL，稱定質量，超聲處理45 min(頻率53 kHz，功率350 W)，放冷，70%甲醇補足損失質量，濾過，即得。

所有患者術后72 h行顱腦增強MRI檢查腫瘤切除情況，根據Simpson分級標準，達到Ⅰ級 58例，Ⅱ級13例，Ⅲ級9例。術后送病理檢查均診斷為腦膜瘤，Ⅰ級良性腦膜瘤59例，Ⅱ級非典型性腦膜瘤21例。術后即時發現，8例多飲多尿者中6例癥狀緩解，2例無明顯改善；5例并發一過性尿崩；4例嗅覺減退；4例顱內感染；1例腦脊液漏；1例出現高熱、血糖升高等嚴重下丘腦反應而死亡；1例大量出血形成腦疝而死亡。隨訪2～7.5年，平均(5.4±1.4)年，56例視力不同程度的改善，21例無明顯變化，3例視力減退。11例復發，復發率為13.8%，再次行手術治療。

2.1.4疊鞘石斛葉指紋圖譜的建立及黃酮色譜峰的確定 精密吸取各批次疊鞘石斛葉供試品溶液2 μL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣，記錄色譜圖，將圖譜導入國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012A版)，見圖1，發現四川產地樣品成分較云南產地樣品成分多。以S1樣品的色譜圖作為參照圖譜，時間窗口設置為0.1，進行多點校正，采用平均數法生成對照圖譜，共標定出29個峰，除峰2，19，21，22，23，28之外，其余23個峰為共有峰。8批四川產樣品相似度為0.968～0.995，2批云南產樣品相似度為0.982，10批樣品與對照圖譜的相似度為0.497～0.987。說明不同產地、生長年份等因素都是造成疊鞘石斛葉成分、含量之間差異性的因素。經二極管陣列檢測器對全部色譜峰的光譜掃描分析(220～380 nm)，除峰1，2，4，11外，其他25個色譜峰所代表的成分可定性為黃酮類物質，結果見表1。采用對照品保留時間定位結合紫外光譜信息，鑒別出2個黃酮碳苷峰(峰5為芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷，峰9為異夏佛塔苷)和1個黃酮醇峰(峰16為蘆丁)。

圖1 10批疊鞘石斛葉指紋圖譜

2.1.5測定法 建立UPLC-PDA法同時測定黃酮類成分的含量，以外標一點法計算芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁3種成分含量；將定性為黃酮類化合物的色譜峰峰面積加和，代入芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷質量-峰面積線性回歸方程，計算總黃酮含量。

2.1.6方法學考察

2.1.6.1專屬性考察 精密吸取“2.1.2.4”項混合對照品溶液與“2.1.3”項供試品溶液各2 μL，按“2.1.1”項色譜條件進樣，結果見圖2。峰5為芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷，峰9為異夏佛塔苷，峰16為蘆丁。

2.1.6.2線性關系考察 取芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁對照品儲備液適量，稀釋成芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷濃度為5.000，10.00，20.00，25.00，50.00，100.0，300.0 μg·mL-1、異夏佛塔苷濃度為4.970，7.455,9.940，11.93，14.91，24.85，49.70 μg·mL-1、蘆丁濃度為4.980，9.960，14.94，19.92，24.90，29.88，49.80 μg·mL-1對照品溶液，按“2.1.1”項色譜條件進樣，以質量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(X)，以峰面積(μV·S)為縱坐標(Y)繪制標準曲線，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 黃酮類成分吸收峰

A.混合對照品；B.供試品；5.芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷；9.異夏佛塔苷；16.蘆丁。

表2 各成分線性關系

2.1.6.3精密度實驗 精密吸取疊鞘石斛葉(批號：181105)供試品溶液2 μL，按“2.1.1”項色譜條件連續進樣6次，測得6份樣品中芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁、總黃酮峰面積RSD分別為0.45%，0.80%，1.87%，0.38%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.1.6.5穩定性實驗 精密吸取疊鞘石斛葉(批號：181105)供試品溶液2 μL，按“2.1.1”項色譜條件分別在0，1，2，3，4，6 h進樣測定，測得芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁、總黃酮峰面積RSD分別為1.25%，0.32%，1.03%，0.59%(n=6)，表明供試品溶液在室溫下6 h內穩定性良好。

2.1.6.6加樣回收率實驗 精密稱取芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁適量，70%甲醇稀釋成芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷濃度為5.500 μg·mL-1、異夏佛塔苷濃度為3.625 μg·mL-1、蘆丁濃度為6.520 μg·mL-1的混合對照品溶液。精密稱取已知含量的疊鞘石斛葉(批號：181105)粉末0.05 g，加入混合對照品溶液10 mL，其余步驟按“2.1.3”項方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.1.1”項色譜條件進樣測定，計算3種單一成分回收率；精密稱取已知含量的疊鞘石斛葉(批號：181105)粉末0.05 g，加入芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷對照品溶液(0.1308 mg·mL-1)10 mL，按“2.1.3”項方法平行制備6份供試品溶液，并按“2.1.1”項色譜條件進樣測定，計算總黃酮成分回收率。芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁、總黃酮的平均回收率分別為99.15%，101.43%，96.42%，101.68%，RSD分別為2.48%，1.86%，2.29%，2.17%，結果見表3。

2.1.7樣品含量測定 取樣品10批，按“2.1.3”項方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下測定，計算芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷、異夏佛塔苷、蘆丁、總黃酮含量(以芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷計)，結果見表4，可見產地四川的疊鞘石斛葉中蘆丁和總黃酮的含量較高，產地云南的疊鞘石斛葉中芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷較高。

表3 4種成分加樣回收率實驗結果

表4 4種成分含量測定結果

3 討論

3.1總黃酮含量測定方法選擇 從指紋圖譜可知，黃酮類成分峰較多，但單個成分含量較低，因此有必要測定總黃酮的含量，更全方面評價石斛藥材的質量。

經查閱文獻可知，在中藥材的黃酮含量測定方法中，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法和AlCl3比色法最常見。有研究者統計過，前者使用頻率高達70%，而且多以蘆丁為對照[12]。但大部分文獻中黃酮含量測定方法在未進行專屬性考察的情況下，直接應用上述兩法進行測定，可能導致含量測定結果不準確。有研究者發現一些常見黃酮類成分(槲皮素、黃芩苷等)顯色后無吸收或吸收弱，而一些非黃酮成分(阿魏酸、綠原酸)在顯色后可產生最大吸收或強吸收，造成黃酮假陰性或非黃酮假陽性的錯誤判斷[13-15]。筆者前期研究使用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法對石斛黃酮進行含量測定時發現，蘆丁對照品最大吸收在510 nm附近，但供試液最大吸收波長在390 nm附近，傳統比色-蘆丁法無法滿足專屬性要求。后使用石斛黃酮的代表成分芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷作為對照，供試液與對照液在390 nm處均有最大吸收，但陰性溶液在該波長處也有吸收，干擾測定。故使用UPLC-PDA法對石斛黃酮含量測定，將定性為黃酮類化合物的色譜峰峰面積加和，計算總黃酮含量，這為建立專屬性強、準確度高的大類成分含量測定方法提供了新思路。

3.2黃酮類成分的確定 黃酮類化合物的吸收特征由桂皮酰系統引起的峰帶Ⅰ(300～400 nm)及苯甲酰系統引起的帶Ⅱ(220～280 nm)組成[16]，本研究通過比較PDA采集的各色譜峰光譜圖是否符合黃酮類物質特征，以判斷該色譜峰所代表物質是否為黃酮類物質。該法較傳統紫外-蘆丁比色法專屬性更強，準確度更高。石斛中的黃酮類成分主要是以芹菜素為苷元的多種黃酮碳苷類，最大吸收波長相近，故以芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷作為對照計算總黃酮含量。

3.3疊鞘石斛葉選擇及總黃酮的測定 石斛中黃酮類成分主要集中在葉內，實驗前期采用UPLC-PAD法對不同基源石斛葉(鐵皮、疊鞘、金釵石斛葉)進行篩選，發現疊鞘石斛葉分離出來的黃酮類成分最多，含量最豐富，故選取疊鞘石斛基源的葉展開黃酮類成分研究。

3.4供試品制備方法的考察 筆者在本研究分別使用回流提取法和超聲提取法對樣品進行提取，發現二者提取效果相當，故選擇操作更為簡便的后者。再對提取溶劑(60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、甲醇)、提取時間(15，30，45，60 min)進行考察，發現70%甲醇對待測成分的親和力最高，提取45 min后芹菜素-6，8-二-C-葡萄苷及總黃酮含量不再增加。故提取方法選擇70%甲醇超聲45 min。

3.5總黃酮抗氧化活性 本研究還對10批樣品的DPPH自由基抗氧化活性進行初步探究，發現總黃酮含量最高的樣品S5的DPPH自由基清除率最高，抗氧化活性最強，表明疊鞘石斛葉抗氧化能力與一定濃度范圍的總黃酮呈正相關。疊鞘石斛葉中各成分與抗氧化活性的關聯度及其構效關系有待進一步探究。

筆者在本實驗建立的“點-線-面”質量分析方法，專屬性強，準確度高，符合中醫傳統理念的整體觀，為疊鞘石斛葉及其他中藥材黃酮類成分定量測定提供了參考。隨著與石斛藥材相關產品的進一步研究開發，以黃酮作為評價指標，將有利于更加全面地評價石斛藥材質量。