十一酸睪酮原位凝膠植入劑避孕效果及對雄性大鼠生殖系統的影響*

張曉偉，金瑛，易東旭，楊立群，張翀，劉丹華，孟勝男

(1.中國醫科大學藥學院藥劑教研室，沈陽 110122；2.遼寧省計劃生育科學研究院，沈陽 110031；3.國家衛健委生殖健康與遺傳醫學重點實驗室，沈陽 110031)

男性激素避孕是一種非常有潛力的避孕手段，目前已經有大量臨床試驗證明了其安全性和有效性[1-2]。但是藥物制劑釋放速度不平穩導致體內激素水平急劇變化帶來的不良反應，如情緒變化、痤瘡、性功能障礙等，降低了人們對這種避孕方法的接受度，也成為男性激素避孕手段繼續發展的瓶頸[3]。因此，對該類激素相關藥物的劑型加以改善，降低激素相關不良反應發生率，不僅有助于男性激素避孕手段的繼續發展，也有助于改進激素補充療法等相關藥物平臺。植入劑是避孕領域最常見的藥物緩釋劑型，但傳統植入劑制備工藝復雜，成本高昂，需要在局部麻醉下進行外科切口后埋植。如果植入劑為生物不可降解型物質，還需額外手術進行清除，使用極為不便，患者順應性差[4-5]。

溶劑沉淀型原位凝膠植入劑(solvent-removal precipitation based in situ forming implant，SRP-ISFI)是將高分子聚合物與藥物一同溶解或溶脹于可與水互溶的適宜有機溶劑中所得可注射制劑[6]。局部注射后，SRP-ISFI中有機溶劑與生理環境中的水相互交換，聚合物沉淀凝固形成半固體或固體藥物緩釋貯庫。目前，SRP-ISFI已經有多種制劑被美國食品藥品管理局(FDA)批準上市，包括Atridox?、Eligard?等[7-9]。SRP-ISFI克服了傳統植入劑缺點，具有可用于病變部位局部給藥、延長釋藥周期、降低給藥劑量和藥物不良反應、避免植入劑手術植入的痛苦、患者順應性好、制備工藝相對簡單等優點。

筆者之前采用聚己內酯丙交酯制備十一酸睪酮原位凝膠植入劑(testosterone ondecanoate-loaded injectable in situ forming implants，TU-ISFI)，并對該制劑工藝和藥物體外釋放機制等進行初步考察，TU-ISFI可以在體外穩定釋放藥物長達3個月[10]。筆者在本實驗觀察該藥在大鼠體內避孕效果及可逆性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 十一酸睪酮(testosterone undecanoate，TU，純度：98%，購自武漢遠成藥業有限責任公司)；TU注射液(浙江仙居制藥股份有限公司生產，批號：180601)；TU-ISFI(本實驗室自行制備[10])。聚己內酯丙交酯[poly (DL-lactide-ε-caprolactone)，PLCA，購自山東岱剛生物技術有限公司，批號：20171110]。其他試劑均為分析純。

8周齡Sprague-Dawley大鼠，雄性體質量200～220 g，雌性體質量180～200 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(遼) 2010-0001。本實驗涉及的動物實驗研究內容，嚴格按照中國醫科大學實驗倫理學相關政策文件規定要求執行。

1.2TU-ISFI的制備 按20%濃度比例稱取適量PLCA溶于N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidone，NMP)，37 ℃攪拌保存過夜，直至得到透明澄清PLCA溶液。將該溶液在65 ℃加熱，除去其中所溶解氣體。分批稱取適量過篩孔內徑0.148 mm篩(100目)TU藥粉，分散在PLCA/NMP溶液，攪拌至完全溶解，使最終所得TU-ISFI載藥量16%。

1.3大鼠血藥濃度測定 將雄性大鼠按體質量隨機分為給藥組和空白對照組，每組40只，給藥組給予TU-ISFI，空白對照組給予不含藥物的同基質同處方原位凝膠注射植入劑。將大鼠麻醉，以20-21號針頭背部皮下注射。注射前后稱重，精密確定給藥劑量。分別于給藥后適當時間點隨機取大鼠5只，尾靜脈取血約0.7 mL。取血后處死大鼠，取出剩余埋植劑，去除包裹組織，蒸餾水洗滌，凍干，甲醇復溶，浸泡，超聲處理2 h，過濾，高效液相色譜(HPLC)法測定埋植劑中殘余TU量(LA-30A，Shimadzu，日本)。血樣經3500 r·min-1離心10 min(r=10 cm)得血漿，-20 ℃冷凍保存。電子發光法測定其中睪酮含量(cobas e 411，Roche，德國)。

1.4藥效學動物分組 將雄性大鼠隨機分為TU-ISFI大、中、小劑量組和十一酸睪酮注射液組(陽性對照組)、空白對照組，每組30只。TU-ISFI大、中、小劑量組分別注射TU-ISFI 600，300，150 mg(相當于TU 3.0，1.5和0.75 mg·kg-1·d-1)，空白對照組給予空白原位凝膠植入劑0.3 g，陽性對照組按1.5 mg·kg-1·d-1劑量按月給藥，共注射3次。給藥后1，3，4個月(因TU-ISFI可持續釋放3個月，給藥后4個月相當于停藥1個月)，每組取10只進行生育力實驗。

1.5生育力實驗 交配生育實驗：取各組雄性大鼠與12周齡雌性大鼠，按♂：♀=1：2合籠。合籠后每天10：00之前檢測雌性大鼠陰道涂片，陰道涂片內出現精子或陰栓時，算一次交配行為。記錄交配情況，將交配過的雌性大鼠編號取出，18 d后處死，記錄子宮內存活胎仔及死胎數。檢測交配行為共進行6 d，6 d后未發現交配行為的雌鼠，也在18 d后處死，觀察懷孕情況。實驗結束計算懷孕率、平均胎仔數、死胎率。

1.5.1生殖系統發育 雄性大鼠配對結束后稱重，脫臼處死，解剖，記錄睪丸、附睪和精囊質量，計算生殖器相對質量。生殖器相對質量=器官質量/體質量×100。

1.5.2睪丸組織細胞形態學 取新鮮分離的大鼠睪丸組織，Bouin’s固定液固定至少24 h。常規上行梯度乙醇脫水、石蠟包埋，切取厚度5 μm組織切片。常規蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察睪丸內細胞形態和精子發生狀況。

1.5.3精子計數和精子活動力測定 另取兩側附睪尾組織各約100 mg，剪碎置15 mL任氏液，37 ℃孵育10 min，使精子在培養液內分散均勻。取一滴精子懸液滴在血細胞計數板上，按照血細胞計數法測定精子密度，并分別計算活動精子數和不活動精子數，換算成精子活動力百分比和每個附睪中精子總數。

1.5.4精子形態 取上述精子懸液30 μL滴在載玻片上，蓋玻片與載玻片呈45度角迅速推膜，制成精液涂片，水平放置10 min，晾干。晾干后浸入95%乙醇與甲醇混合液中固定2～3 min，取出后再次晾干。常規HE染色，磷酸鹽緩沖液沖洗調色，高倍顯微鏡下觀察精子形態。

1.6統計學方法 采用SPSS 19.0版軟件對實驗數據進行統計分析，計數資料采用卡方檢驗，計量資料采用單因素方差分析法和t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1大鼠體內釋放情況 TU-ISFI在血漿中的睪酮濃度-時間曲線見圖1。植入后，給藥組血漿睪酮濃度迅速超過空白對照組，7 d后給藥組血漿睪酮水平開始急劇上升，28 d達到最大值，然后開始緩慢下降，90 d血漿睪酮濃度與空白對照組持平。實驗結果提示TU-ISFI可在3個月內持續維持大鼠體內較高血漿睪酮濃度，3個月后大鼠體內睪酮水平回落至正常。植入劑殘余藥量測定結果表明，TU-ISFI在大鼠體內藥物突釋量較小，第7天共釋放約14.7%藥物，第28天共釋放約47.3%，第63天累積釋放量達到89.9%，第90天時基本全部釋放。

圖1 兩組大鼠血漿睪酮濃度變化

2.2交配生育實驗結果 結果見表1。給藥1個月后，TU-ISFI大、中、小劑量組和陽性對照組懷孕率和平均胎仔數均較空白對照組高，此時外源性睪酮已經開始抑制新的精子產生，但由于大鼠精子整個發生時程為48 d，睪酮主要在精子產生初期發生作用，因此1個月時還不能達到避孕效果。大鼠精子發生周期時程為12 d，整個精子發生時程為48 d，給藥1個月，因為睪丸內睪酮水平下降，導致減數分裂期和精子形成期生精細胞大量丟失，但對已經成熟或者接近成熟的精子不起抑制作用，因此不能達到完全避孕效果。給藥3個月后，TU-ISFI大、中劑量組可達到100%成功避孕；TU-ISFI小劑量組避孕成功率75%，懷孕胎仔數明顯下降；陽性對照組避孕成功率90%，10只雄鼠中有1只雄鼠的兩只配對雌鼠懷孕，未達到100%避孕效果。停藥1個月后，TU-ISFI大、中、小劑量組繁殖能力開始恢復，陽性對照組繁殖能力仍受到抑制。

表1 大鼠交配生育實驗的結果

2.3生殖系統發育分析 結果見圖2。給藥后1個月，與空白對照組比較，TU-ISFI大、中、小劑量組生殖器整體相對質量增加，睪丸質量減輕，精囊增大，附睪無明顯變化；陽性對照組生殖系統整體質量下降，睪丸、附睪均縮小，精囊稍增大。給藥后3個月，與空白對照組比較，其他各組生殖系統整體質量較低，主要由于睪丸和附睪萎縮，其中TU-ISFI大、中、小劑量組睪丸質量約為空白對照組的50%，陽性對照組睪丸質量為空白對照組的三分之一。停藥后1個月，TU-ISFI大、中、小劑量組睪丸和附睪大小恢復較快，陽性對照組生殖系統恢復較慢。

2.4睪丸組織細胞形態學檢測 結果見圖3。給藥后1個月，TU-ISFI各劑量組睪丸曲細精管內各級精母細胞、精子細胞、精子及間質細胞均清晰可辨，未見明顯形態學變化；陽性對照組部分曲細精管內生殖細胞蛻變，壞死脫落。給藥后3個月，TU-ISFI大劑量組和陽性對照組大部分曲細精管內生殖細胞明顯減少，排列疏松，層次變薄，腔緣不整齊；精子、精子細胞及精母細胞部分蛻變，脫落；部分區域管腔皺縮，細胞稀少，腔內空虛，近基底膜僅見少許散在精原細胞、精母細胞或支持細胞，部分僅襯覆幾個精原細胞，管腔內明顯可見多個多核巨細胞。TU-ISFI中、小劑量組可見局部曲細精管內生殖細胞減少，排列疏松，層次變薄，細胞稀少，部分腔內空虛，近基底膜僅見少許散在的精原細胞，支持細胞或蛻化中的精母細胞亦見多核巨細胞。與TU-ISFI大劑量組比較，TU-ISFI中、小劑量組形態學變化及范圍具有明顯劑量依賴性。

圖2 TU-ISFI對大鼠體質量和生殖系統發育的影響

停藥后1個月，陽性對照組大部分曲細精管仍皺縮，生殖細胞明顯較少，排列疏松，層次變薄，細胞稀少，腔內空虛，近基底膜僅見少許精原細胞、精母細胞及支持細胞，小部分曲細精管內生精細胞清晰可見，仍見精子發生。TU-ISFI大、中、小劑量組可見部分區域曲細精管內生殖細胞減少，排列疏松，層次變薄。局部曲細精管內生殖細胞蛻變，壞死，脫落，腔內空虛，但大部分曲細精管內各級精母細胞、精子細胞及正常精子均清晰可辨，間質未見明顯形態學變化，其形態學變化及范圍具有明顯劑量依賴性。

2.5精子計數和精子活動力 結果見表2。給藥后1個月，與空白對照組比較，其他各組精子數量明顯下降，下降程度依次為：陽性對照組>TU-ISFI大劑量組>TU-ISFI中劑量組>TU-ISFI小劑量組，可能由于外源性睪酮作用，TU-ISFI大、中、小劑量組精子活力與空白對照組相比顯著提高。給藥3個月后，除空白對照組外，其他各組精子數均極少，TU-ISFI大、中劑量組精子活動力為0，TU-ISFI小劑量組和陽性對照組精子活動能力底下。停藥1個月后，TU-ISFI大、中、小劑量組精子數有所恢復，精子活動率回升至20%以上，陽性對照組仍處于被抑制狀態。

圖3 5組睪丸組織形態學變化(St.睪丸精子細胞；Sc.精母細胞；Sg.精原細胞；G.多核巨細胞；*.曲細精管空腔；×400)

2.6精子形態 給藥1個月時，TU-ISFI中、小劑量組精子形態未見明顯異常；TU-ISFI大劑量組可見個別異常形態精子，主要表現為尾部折疊、頭部無鉤等；陽性對照組可見大量異常形態精子，主要表現為無定形、胖頭等。給藥3個月，陽性對照組出現大量精母細胞，精子細胞及精子蛻變、壞死，大量精子出現無頭、斷尾等畸形表現；TU-ISFI大、中、小劑量組出現大量精母細胞、精子細胞及精子蛻變、壞死，精子形態學變化均與陽性對照組相近，程度略低。

停藥1個月后，TU-ISFI大、中、小劑量組仍可見單個精母細胞及精子細胞蛻變、壞死，精子形態大部分完好，畸形率較低，形態學變化與給藥1個月時相近；陽性對照組可見部分蛻變壞死精母細胞、精子細胞及精子，部分精子畸形，主要是無鉤、胖頭、斷尾等。

3 討論

我國曾開展過TU注射液用于男性激素避孕的臨床多中心研究，該研究中，TU在男性避孕方面的有效性得到肯定，但在不良反應發生率以及安全性方面存有質疑。此外，部分受試者希望能夠有更長效的TU制劑[11]。

表2 5組不同時間附睪精子數和精子活動率

圖4 5組精子形態變化(Sp.精子；WBC.白細胞；ab-SP.畸形精子；d-Sc.退變壞死的精母細胞；×400)

本研究結果表明，給藥1個月后，TU-ISFI各劑量組精子數有所下降，但精子活動力上升，因此母鼠妊娠率較空白對照組高。大鼠精子發生周期時程為12 d，整個精子發生時程為48 d，給藥1個月時，因為睪丸內睪酮水平下降，導致減數分裂期和精子形成期生精細胞大量丟失，但對已經成熟或者接近成熟的部分精子起不到抑制作用，因此不能達到完全避孕效果。給藥3個月后，各劑量組均達到抑制精子發生效果，在避孕效果上，TU-ISFI大、中劑量組優于陽性對照組，避孕率達到100%。實驗發現，給予大鼠小劑量TU并不能對睪丸本身合成和分泌睪酮的功能實現完全干擾，仍有極少部分有活力精子產生，導致避孕失敗。從停藥1個月后恢復情況看，由于后期TU-ISFI釋放藥物量逐漸降低，避免了陽性對照組每個月一次給藥帶來的波谷現象，有利于停藥后精子數目和精子活力恢復。

綜上所述，TU-ISFI以300～600 mg劑量(即1.5～3.0 mg·kg-1·d-1劑量TU)對大鼠給藥后可達到優于陽性對照組的避孕效果，停藥后大鼠生殖能力可迅速恢復。后續研究中，筆者還將考察其安全性和不良反應發生情況，對其劑量進一步篩選。從目前研究來看，TU-ISFI具有平穩藥物緩控釋能力，對雄性大鼠避孕效果優良，作用更為溫和并且可靠，是一種具有廣闊應用前景的激素補充制劑和男性避孕制劑。