枸櫞酸愛地那非人肝微粒體代謝產物鑒定及性別差異*

趙曉悅，宋俊科，杜冠華

(北京協和醫學院&中國醫學科學院藥物研究所藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050)

磷酸二酯酶是有多種亞型的一類以磷酸酯為底物的水解酶，Ⅴ型磷酸二酯酶(phosphodiesterase 5，PDE5)主要分布于陰莖海綿體、肺、大腦、血管平滑肌細胞，血小板以及心肌細胞，可特異性水解環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate， cGMP)，從而調節陰莖和肺等器官或組織中血管平滑肌收縮力，參與血小板聚集過程，影響腦內cGMP信號傳導途徑[1]。2005年，美國食品藥品管理局(FDA)批準PDE5選擇性抑制藥西地那非用于治療肺動脈高壓，緩解患者呼吸困難等癥狀[2]。PDE5選擇性抑制藥對于心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病的治療和預防作用也受到越來越多的研究和關注。

枸櫞酸愛地那非是我國自主研發的一種高效PDE5選擇性抑制藥，屬于化學藥品第 1.1類新藥[3]。與同類藥物分子相比，愛地那非分子對PDE5的特異性結合力強，結構共平面性好，酯水分配比合理，有利于藥物吸收和分布[4]。由于愛地那非前期開發主要針對男性勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)的臨床治療，其臨床前研究全部使用雄性動物，臨床試驗受試者也均為男性[5-10]。因此，探究性別差異對愛地那非代謝的影響，對于愛地那非藥理學應用的開發和研究十分必要。

筆者在本研究建立不同性別來源人肝微粒體體外代謝孵育體系模型，通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜技術，鑒定愛地那非代謝產物，探究不同性別人肝微粒體代謝差異，以期為擴大臨床應用范圍提供實驗依據。

從學生的舉例中選擇一個命題，做為課堂研究的對象.如在本節課中，有同學舉例“若2b=a+c，則a,b,c成等差數列”，以下討論便圍繞此命題展開.

在鉆進機構抵達限幅機構預定位置時，對接鎖合組件能夠實現限幅機構與鉆進機構的鎖定，從而使得限幅機構與鉆進機構進行隨動，保證后續的鉆取采樣作業順利進行。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 人肝S9，混合人源肝微粒體，男性肝微粒體，女性肝微粒體[購買自瑞德肝臟疾病研究(上海)有限公司，批號：X008023(人肝S9)，X038076(混合人源肝微粒體)，MX008064(男性肝微粒體)，FX008064(女性肝微粒體)]；枸櫞酸愛地那非原料藥(悅康藥業集團股份有限公司，批號：019141102，)；其他試劑與溶劑均為市售分析純。

1.2儀器 Waters CQUITY UPLC液相色譜系統，Waters Xevo G2 QTof質譜儀，Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，USA)；高速冷凍離心機(美國Beckman)；Eppendorf移液器(德國Eppendorf)；Eppendorf離心機(德國Eppendorf)。

1.4人肝微粒體孵育體系 孵育體系終體積1 mL，其中人肝S9或微粒體蛋白質濃度1 g·L-1，愛地那非濃度100 μg·mL-1，以三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)緩沖液(pH值=7.4)補齊體積。37 ℃預孵5 min，加入終濃度1 mmol·L-1煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide ademine dinucleotide phosphate，NADPH)輔酶溶液啟動反應。37 ℃恒溫孵育 8 h。到達終點后加入5倍體積(5 mL)冰乙腈終止反應，振蕩3 min，高速離心10 min，吸取上清液吹干。復溶后振蕩離心，取上清液進樣。對照組不加愛地那非，以Tris-HCl緩沖液代替，其余同上述處理過程。

M4為愛地那非的N-N'脫烷基產物。M4的準分子離子峰m/z 449.1966比原準分子離子低40.0313 Da，元素組成為C20H28N6O4S，表明原分子丟失了C3H4結構。M4的二級質譜中存在碎片離子m/z 377.1311，312.1694，和284.1315，而不存在m/z 113.1099和99.0924，表明哌嗪環結構破壞(N，N'-脫異丙基)。

1.5代謝產物的檢測和鑒定 ①數據庫的建立。使用ChemDraw軟件繪制愛地那非化合物結構式，連同微粒體代謝可能發生的所有反應類型(包括Ⅰ相反應和Ⅱ相反應)等相關信息一起導入沃特世UNIFI 科學信息系統平臺系統，形成數據庫；②獲得初步鑒定結果。由UNIFI軟件根據導入的信息自動鑒定識別可能的代謝產物，并設置過濾器參數對識別結果進行初步篩選，過濾掉響應值<2000、精確質量數誤差>10×10-6的化合物，得到初步的化合物鑒定結果；③人工識別和鑒定。參考已有文獻報道，結合愛地那非質譜特征、相對保留時間、精確分子質量、分子式和多級質譜碎片等信息，對初步鑒定結果進行驗證核查，得到最終代謝產物鑒定結果。

1.3分析條件 色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相：A為乙腈，B為0.4%甲酸溶液；洗脫程序：0～2 min(10% A)，>2～47 min(10%→100% A) ，>47～52 min (100% A)，>52～55 min(100%→10% A)， >55～60 min (10% A)；流速0.3 mL·min-1；進樣量為5 μL。

由于目前的企業大多屬于經營權和所屬權背離，所以公司的董事會與監理會需要展現其應該具備的功能，對管理階層開展的工作實施監管，嚴謹預防管理階層造假，蒙蔽審計者，導致企業在信譽層面出現虧空，同時給公司長久的發展收益帶來影響。另外作為企業的董事層，需要多加入企業的人才挑選與培養，重視公司財務近期的情況的時候，針對財務部門用人機制需要嚴格把控，嚴謹防止一人多崗，崗位不劃分的狀況出現。

2 結果

M3為愛地那非中的N-S鍵斷裂并引入羥基的產物。M3的準分子離子峰m/z 393.1227，比原準分子離子低96.1052 Da，元素組成為C17H20N4O5S，且不存在碎片離子m/z 113.1099和99.0924，表明哌嗪環丟失，吡唑吡啶結構中引入一個羥基。M3的碎片離子m/z 365.1019元素組成為C15H17N4O5S，表明苯環上C-O鍵斷裂，丟失C2H4結構。 碎片離子m/z 312.1657和284.1348與原分子相同，表明羥基在C-S鍵斷裂后裂解，推測羥基被引入到與C-S鍵相鄰的碳中。

2.2愛地那非代謝產物的LC-MS表征及性別代謝比較 在NADPH存在的體外人肝微粒體孵育體系中，愛地那非產生了多個代謝產物。圖2顯示了愛地那非在人肝S9、混合人源肝微粒體、男性肝微粒體、女性肝微粒體孵育體系中代謝8 h得到的代謝產物總離子色譜圖。由表1可知，混合人源肝微粒體、男性肝微粒體和女性肝微粒體中均檢測到了全部8種代謝產物；人肝S9中檢測到除M5和M7以外6種代謝產物。表1詳細總結了愛地那非及其8種代謝產物的化學式、準確質量、保留時間、碎片離子信等詳細色譜和質譜信息。8種代謝產物的推測結構和代謝過程如圖3所示。

圖1 愛地那非的MS/MS譜圖及可能的質譜裂解途徑

2.3愛地那非代謝產物的LC-MS鑒別 M1和M2 為愛地那非的羥基化產物。M1和M2的準分子離子峰m/z 505.2228比原準分子離子高15.9949 Da，分子式為C23H32N6O5S，表明原分子中引入了一個氧原子。M1的二級質譜解析中包括碎片離子m/z 487.2310(C23H31N6O4S，-H2O)，375.1121，310.1525，282.1216，113.1055，99.0945。其中m/z 375.1121(C17H19N4O4S)，310.1525(C17H17N4O2)，282.1216(C15H13N4O2)比原分子的離子碎片m/z 377.1311(C17H21N4O4S)，312.1585(C17H19N4O2)，284.1281(C15H15N4O2)低2 Da(-2H)，表明羥基的引入位置是吡唑吡啶結構中的丙基側鏈。碎片離子m/z 113.1055，99.0945與原分子相同，表明M1中哌嗪結構完整。而與M1不同的是，M2中碎片離子m/z 377.1272，312.1657，284.1281與原分子相同，而m/z 111.0959(C6H11N2)比原分子的碎片離子m/z 113.1099(C6H13N2)低2 Da，表明M2的羥基化發生在哌嗪結構中。

A.人肝S9代謝；B.混合人源肝微粒體代謝；C.男性肝微粒體代謝；D.女性肝微粒體代謝。

圖3 愛地那非在體外人肝微粒體中的代謝途徑

表1 愛地那非及其在人肝微粒體中代謝產物的質譜表征

2.1愛地那非的液相色譜-質譜(LC-MS)表征 采用LC-MS方法檢測愛地那非色譜和質譜裂解行為。保留時間13.6 min，準分子離子峰[M + H]+為m/z 489.227 9，分子式為C23H32N6O4S，見圖1。愛地那非產生的二級碎片離子有m/z 377.1311，312.1585，284.1281，113.1099和99.0924。愛地那非分子失去哌嗪結構(m/z 113.1099)形成碎片離子m/z 377.1311，而后通過C-S鍵裂解形成碎片離子m/z 312.1585，C-O鍵斷裂又進一步形成碎片離子m/z 284.1281。碎片離子m/z 113.1099失去烷基產生m/z 99.0924。這些碎片離子信息可用于后續代謝產物的鑒定和分析。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流速600 L·h-1，錐孔氣體流速50 L·h-1，錐孔電壓30 V，毛細管電壓3 kV，質量掃描范圍m/z 50～1200。使用MassLynx V4.1進行數據采集與分析。

M5為M4脫氨基并發生羥基化的產物。M5的準分子離子峰m/z 448.1649比M4的準分子離子低1.0371 Da，元素組成為C20H25N5O5S，表明在M4分子基礎上發生脫氨基變化的同時又引入一個羥基。通過碎片離子m/z 377.1311，311.1547，283.1222的存在推定羥基的引入位置在破壞后的哌嗪結構中。

M6是愛地那非的羥基化和去甲基產物。M6的準分子離子峰m/z 491.2071比原準分子離子高1.9792 Da，元素組成為C22H30N6O5S，表明丟失甲基(-CH2)并引入氧原子。M6的二級質譜中存在碎片離子m/z 377.1272，311.1511和284.1349，而不存在m/z 113.1099和99.0924，表明在哌嗪結構中發生了羥基化和甲基丟失。

M8為M7的脫氫產物。M8的準分子離子峰m/z 501.1915比M7的準分子離子低2.0156 Da，元素組成為C23H28N6O5S，表明在結構上失去兩個氫原子。M8的二級質譜結構與M7相比缺少碎片離子m/z 111.0916，說明失去的氫原子來源于哌嗪結構，脫氫變化后哌嗪結構被破壞。

M7為愛地那非的羥基化和脫氫產物。M7的準分子離子峰m/z 503.2071比原準分子離子高13.9792 Da，元素組成為C23H30N6O5S，表明結構上引入一個羥基并脫去兩個氫原子。M7的碎片離子m/z 111.0916比原分子的碎片離子m/z 113.1070(C6H13N2)低2.0154 Da，其他碎片離子m/z 377.1351，311.1582和284.1349與原分子相同，表明在哌嗪結構上發生脫氫變化并引入了氧原子

式中,k(·,·)θc是關于參數θc的協方差函數。一般而言,協方差函數決定了分布的平滑程度。各向同性均方指數核函數是經常使用的協方差函數形式,其解析形式如下:

高校圖書館的特色資源是高校資源的優勢所在，越來越凸顯其不可替代的核心作用，并儼然成為圖書館核心競爭力的重要指標。特色資源為教學科研以及專業人才培養提供了有力的資源保障。

由表3可知，在該實驗條件下加標回收率范圍為99%～102%，相對誤差范圍為±2%，得到的的實驗結果準確度較高。

3 討論

研究表明，西地那非在小鼠體內的的免疫調節作用存在藥動學和藥效學相關的性別依賴性差異[11]。因此，在愛地那非的開發過程中，性別差異性研究十分重要。

本研究采用UPLC-Q-TOF MS法，最終共鑒定代謝產物8種，均為水溶性，無明顯毒性結構的Ⅰ相代謝產物。其中M7(羥基化并脫二氫產物)和M8(M7進一步脫氫產物)為首次報道的代謝產物。

3種不同性別人肝微粒體孵育體系檢測到的代謝產物種類一致，表明愛地那非在不同性別人群肝臟微粒體代謝過程中不存在代謝產物差異。由此推測，不同性別的人群對愛地那非的肝臟代謝過程一致，女性患者在服藥過程中，不會因肝微粒體代謝過程而增加未知副作用。人肝S9樣品中發現6種代謝產物，多為相對含量較高的代謝產物，推測這與人肝S9中酶成分較肝微粒體更為復雜，酶含量相對較低有關。

開展愛地那非的藥物代謝性別差異研究，可以幫助闡明藥物的毒副作用，對于藥動學、藥效學和藥物的安全性評價等研究具有重要意義，為新適應證的開發提供了數據支持，同時為體外實驗的結果外推至體內試驗提供了理論支持。