ε-聚賴氨酸對柑橘酸腐菌的抑菌活性及作用機制

肖 媛，潘兆平，尹春曉，蘇 瑾，胡 筱，朱向榮,，單 楊，付復華,

（1.湖南大學研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省農業科學院農產品加工研究所，湖南 長沙 410125；3.果蔬貯藏加工與質量安全湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410125）

柑橘是世界第一大水果，我國是柑橘的主要生產和消費大國[1]。柑橘果實富含多種營養物質及生物活性成分，深受消費者喜愛[2]。但由于柑橘類水果成熟期集中，含水量較高且營養成分豐富，采后極易感染病原菌而發生霉變、腐爛，降低品質，造成了較大資源浪費和環境污染問題[3]。由柑橘酸腐菌（Geotrichum citri-aurantii）引起的酸腐病是柑橘類果實在采后貯運中最重要的病害之一，其發病率僅次于綠霉病和青霉病[4]，幾乎影響到世界各產地所有柑橘類作物與栽培品種[5]。柑橘酸腐菌有較強的侵染力，且具有生長周期短、繁殖快、對環境適應能力強、不易被殺菌劑殺死、難以控制等特點[6]。酸腐病在柑橘采后貯藏后期易爆發，染病后果實腐爛液化易相互影響造成交叉感染，引起大面積的腐爛，危害巨大[7]。目前，化學殺菌劑是生產上防治柑橘采后病害的主要技術，大部分殺菌劑如咪鮮胺、抑霉唑、噻菌靈、嘧霉胺等可有效控制柑橘青綠霉病，但對柑橘酸腐病的防治有限[8]。聯苯酚鈉在一定濃度下能夠有效防治酸腐病，但因其對果實有損傷作用，使用量逐漸減少[9]。雙胍鹽類對酸腐病的控制有特定效果，因不明確其代謝途徑，無法有效檢測其殘留量，使其使用范圍受限[5,7]。化學殺菌劑防治技術具有高效、廣譜和使用方便等特點，其廣泛使用的同時，安全性等問題也引起了人們的高度關注。許多化學殺菌劑有致癌性、毒性大、易殘留等問題，處理不當會對人的身心健康和生態環境安全有害[10]。另外，若長時間用一種或幾種藥劑，極易增強病原菌對藥劑的耐藥性，最終導致病害更難防治[11]。因此，亟需尋找安全、有效的防治措施來控制柑橘采后酸腐病的發生。

ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）來源于白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）發酵產生的代謝產物[12]，是一種高安全性的天然食品保鮮防腐劑。ε-PL是一種均聚氨基酸，是由單個賴氨酸分子α-位羰基和ε-位氨基通過酰胺鍵結合的聚合物，其有25～30 個賴氨酸殘基[13]。與化學防腐劑相比，ε-PL是生物發酵產物，更安全，其在體內能分解為人體需要的賴氨酸[14]。而且，ε-PL還具有抑菌譜廣、耐高溫、水溶性好、pH值使用范圍廣等優點[15]。ε-PL已被中國與美國等國家批準為安全食品保鮮劑[14,16]，廣泛用于熟肉制品、蛋制品以及果蔬汁等多種食品的保鮮防腐。近年來，關于ε-PL的抑菌特性與抑菌機理的研究得到了廣泛的關注。Lin Lin等[17]研究了ε-PL對李斯特菌的抗菌機制，結果表明經質量濃度為200 mg/L的ε-PL處理能抑制99.99%李斯特菌的生長繁殖，帶正電荷的ε-PL與李斯特菌細胞膜表面的脂磷壁酸等帶負電荷的基團結合使細胞膜的結構發生變化，引起胞內酶與可溶性蛋白的外流，菌體正常呼吸代謝功能紊亂，最終導致細胞凋亡。Bo Tao等[18]研究報道質量濃度為50～200 mg/L的ε-PL處理導致釀酒酵母細胞膜的一系列變化，包括增加麥角甾醇含量，改變脂肪酸組成，對膜蛋白的構象與功能造成影響，引起菌體滲透脅迫作用和質壁分離的發生。Li Hua等[19]發現質量濃度150～450 mg/L的ε-PL處理對灰霉菌的細胞膜具有損傷作用，膜完整性的破壞能夠引起胞內可溶性碳水化合物及核酸的滲漏，促進其體內活性氧的積累，并導致菌體內BcXyn11A與BcRAS1等致病基因的表達下調，最終抑制灰霉菌的生長繁殖，有效降低紅棗灰霉病的發病率。

ε-PL是一種安全、健康、綠色的防腐保鮮劑，對多種細菌和真菌有直接抑制作用，具有廣闊的商業應用前景[20]。ε-PL對大腸桿菌O157:H7[21]、金黃色葡萄球菌等[22]食源性病原菌及灰霉菌[19]、粉紅單端胞霉[23]、指狀青霉[24]等常見的果蔬采后致病真菌均有較好的抑菌活性，但目前鮮有關于ε-PL抑制柑橘酸腐菌的研究報道。本實驗以柑橘酸腐菌為材料，分析了ε-PL對柑橘酸腐菌的抑制效果及抑菌特性，并進一步探討了ε-PL對柑橘酸腐菌的抗菌機制，旨在為柑橘采后酸腐病的控制研究提供新思路，為研發適合柑橘貯藏的新型防腐保鮮劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

柑橘酸腐菌（Geotrichum citri-aurantii） 中國科學院華南植物園微生物實驗室；沙糖橘為市場采購，產自廣西桂林。

ε-聚賴氨酸 上海富源生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose broth，PDB）液體培養基鄭州亞世生物科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TGL-16M臺式高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；SW-CJ-1C型凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；血細胞計數板 上海求精生化試劑儀器有限公司；DDS-307A電導率儀 上海儀電科學有限公司；TS-100B臺式空氣浴搖床 金壇市精達儀器制造有限公司；XSP-36X型顯微鏡 鳳凰光學儀股份有限公司；UV-180型紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；JSM-6360LV型高低真空掃描電子顯微鏡、JFD-320冷凍干燥儀 日本電子株式會社；SP8 STED 3X型激光共聚焦顯微鏡 徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ε-PL對柑橘酸腐菌的最小抑菌濃度的測定

將柑橘酸腐菌接種至PDA培養基上，放置于28 ℃恒溫培養箱培養7 d，用無菌水將柑橘酸腐菌洗入三角瓶中，用普通玻璃珠將孢子打散、過濾，將濾液充分搖勻制成孢子懸浮液。采用微量肉湯稀釋法研究ε-PL對柑橘酸腐菌最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[8,25-26]。用無菌的96 孔微量板進行實驗，分別加入100 μL PDB培養基。吸取100 μL質量濃度為51 200 mg/L的ε-PL溶液加入A1號孔板，采用倍半濃度稀釋法依次從A2號孔板稀釋至A11號孔板。在A1～A10號孔板和A12號孔板中加入100 μL含柑橘酸腐菌孢子濃度為107CFU/mL的PDB培養基，使A1～A10號孔板中ε-PL質量濃度為12 800～25 mg/L。A11號孔板為空白對照，只加入培養基和ε-PL溶液，不接種菌液。A12號孔板為菌液對照組，不含ε-PL溶液28 ℃培養48 h后，用顯微鏡觀察其菌絲生長，以A1～A10號孔板中仍保持澄清的最低ε-PL質量濃度為ε-PL對柑橘酸腐菌的MIC，每個質量濃度設置8 個平行。

1.3.2 ε-PL處理對柑橘酸腐菌菌絲體生長的抑制效果

將PDA培養基于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min后取出，在培養皿中分別加入不同質量濃度的ε-PL和PDA培養基，充分混勻，使每個平板培養基中ε-PL溶液的質量濃度分別為0（對照組）、50、100、200、400、600、800 mg/L（均為處理組），備用。從用PDA培養基培養7 d的柑橘酸腐菌菌落邊緣取直徑為6 mm的菌餅，將菌餅分別接種于平板培養基正中央，每個平板接種一個菌餅，菌絲面朝下，28 ℃培養箱中培養7 d[27]。每組重復3 次。菌落增長直徑與菌絲體生長抑制率分別按公式（1）、（2）計算。以ε-PL質量濃度的對數值作為橫坐標，菌絲體生長抑制率為縱坐標，計算ε-PL對柑橘酸腐菌菌絲體生長的毒力方程和半最大效應濃度（half maximal effective concentration，EC50）[28]。

1.3.3 ε-PL處理對柑橘酸腐菌孢子萌發抑制率的測定

采用涂布平板法測定ε-PL處理對柑橘酸腐菌孢子萌發的影響。柑橘酸腐菌在PDA平板上28 ℃培養7 d后，用無菌水洗下孢子，用無菌紗布過濾除去菌絲，將濾液在5 000 r/min下離心10 min，去除上清液，將柑橘酸腐菌孢子重懸于PBS溶液中，用血球計數板調節孢子濃度至106CFU/mL，制成孢子懸浮液備用。吸取50 μL孢子懸液涂布在含質量濃度0（對照組）、50、100、200、400、600、800 mg/L（均為處理組）的ε-PL平板上[29]，每個處理3 次重復，置于28 ℃培養箱中培養6 h，直到對照組的萌發率達到95%以上，每皿隨機觀察100 個孢子，統計孢子萌發數/個，以芽管長度超過孢子最大直徑的一半作為萌發標準[30]。孢子萌發率和孢子萌發抑制率分別按公式（3）、（4）計算。以ε-PL質量濃度的對數值作為橫坐標，柑橘酸腐菌孢子萌發抑制率為縱坐標，計算ε-PL對酸腐菌孢子萌發的毒力方程和EC50[31]。

1.3.4 柑橘酸腐菌細胞膜通透性的測定

將1×106CFU/mL的柑橘酸腐菌孢子懸浮液接種于PDB培養基中，于28 ℃且轉速為200 r/min的搖床中進行振蕩培養3 d。4 000 r/min離心20 min后用無菌水離心沖洗3 次。將離心后的菌絲體置于25 mL的無菌水中，加入ε-PL使其質量濃度分別為1×MIC、2×MIC，于28 ℃且轉速為200 r/min搖床培養并測定處理0、2、4、6、8、10、12 h時的胞外電導率L/（μS/cm）。最后用沸水煮沸處理10 min，冷卻至室溫，再次測定的電導率為L’，實驗重復3 次。用相對電導率表示細胞膜通透性，相對電導率按公式（5）計算[32-33]。

式中：L為各時間點的電導率/（μS/cm）；L0為0 h的電導率/（μS/cm）；L’為沸水處理后的電導率/（μS/cm）。

1.3.5 柑橘酸腐菌胞內物質釋放量的測定

將1×106CFU/mL的柑橘酸腐菌孢子懸浮液接種于25 mL的PDB培養基中，于28 ℃且轉速為200 r/min的搖床中進行振蕩培養3 d。4 000 r/min離心20 min后用無菌水離心沖洗3 次。將離心后的菌絲體置于25 mL的無菌水中，加入ε-PL使其質量濃度分別為1×MIC、2×MIC，加入等量無菌水為對照組[8,34]。于28 ℃且轉速為200 r/min搖床培養，于0、2、4、6、8、10、12 h時取樣，將樣品置于12 000 r/min離心3 min收集上清液2 mL，在260 nm波長處測定吸光度，實驗重復3 次。

1.3.6 柑橘酸腐菌細胞膜完整性的測定

將柑橘酸腐菌孢子添加到ε-PL質量濃度分別為1×MIC、2×MIC的PDB培養基中，調整孢子濃度為1×107CFU/mL，以無菌水作對照。置于28 ℃且轉速為200 r/min的搖床中孵育6 h后，4 000 r/min離心3 min去上清液，加入500 μL的PI染色液，37 ℃水浴避光染色10 min。用PBS清洗3 次，去除多余染色液，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察[35-36]。

1.3.7 掃描電子顯微鏡觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察ε-PL處理后真菌菌絲的形態學變化。將6 mm的菌餅接種到質量濃度為0、1×MIC、2×MIC的ε-PL的PDA培養基中28 ℃恒溫培養7 d后，取平板中的菌絲（6～8 mm3）[27]，用體積分數2.5%磷酸戊二醛與2%多聚甲醛固定2 h以上，放置于4 ℃冰箱。用體積分數0.1% PBS清洗戊二醛3 次，每次40 min。將樣品放置于體積分數1%鋨酸固定2 h后，用體積分數1% PBS清洗3 次，每次5 min。樣品于體積分數30%、50%、70%、90%乙醇和無水乙醇梯度脫水，每隔10 min一次。最后將樣品放置于真空冷凍干燥機中干燥，取出貼臺后噴金鏡檢。

1.3.8 柑橘果實酸腐病發病率和病斑直徑的測定

挑選無損傷、大小著色一致的柑橘果實，隨機分為4 組，每組10 個果實。在其表面噴灑體積分數75%乙醇進行消毒，用無菌水沖洗后，晾干。用滅過菌的打孔器在果實腰部等距離刺兩個直徑為3 mm、深3 mm的傷口，接種濃度為2×104CFU/mL孢子懸浮液20 μL，晾干后，處理組分別加入20 μL質量濃度為1 600、3 200 mg/L和6 400 mg/L的ε-PL溶液至傷口，對照組加入20 μL無菌水。接種后置于塑料盒，用自封袋密封置于25 ℃、相對濕度為90%～95%的條件下培養8 d后，測定柑橘果實的發病率，用十字交叉法測量柑橘果實的病斑直徑，實驗重復3 次[4,9]。

1.4 數據統計分析

實驗平行測定3 次，采用Excel軟件進行統計數據，結果以平均值±標準差表示。采用DPS 7.05軟件繪制標準曲線，利用Origin 2018軟件進行制圖，應用SPSS 17.0軟件對數據進行方差分析，利用鄧肯氏多重比較進行差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 ε-PL對柑橘酸腐菌的MIC

表1 列出了ε-P L 對柑橘酸腐菌的M I C 值，質量濃度≥400 mg/L的ε-PL對柑橘酸腐菌有較好的抑菌效果。經微量肉湯稀釋法測定可知，ε-PL對柑橘酸腐菌的MIC為400 mg/L。

表1 ε-PL對柑橘酸腐菌的MICTable 1 MIC of ε-PL against Geotrichum citri -aurantii

2.2 ε-PL處理對柑橘酸腐菌菌落形態、菌落直徑的影響

由圖1A、B可知，隨著ε-PL質量濃度的升高，對柑橘酸腐菌菌絲體生長的抑制作用逐漸增強。培養7 d后，當ε-PL的質量濃度≥400 mg/L時，可明顯抑制菌絲體的生長（圖1A1～A7）。培養2 d后，與對照組相比ε-PL處理組可以顯著抑制酸腐菌菌絲體的生長（P＜0.05），當ε-PL的質量濃度≥400 mg/L時，柑橘酸腐菌基本無生長。培養7 d后，對照組菌絲體生長迅速，菌落直徑達到了（76.83±0.14）mm（圖1B）。

圖1 ε-PL對柑橘酸腐菌菌落形態、菌落直徑的影響Fig. 1 Effect of ε-PL treatment on colony morphology and diameter of Geotrichum citri-aurantii

2.3 ε-PL處理對柑橘酸腐菌孢子萌發、菌絲體生長的影響

圖2 ε-PL處理對柑橘酸腐菌孢子萌發的影響Fig. 2 Effect of ε-PL treatment on spore germination rate of Geotrichum citri-aurantii

由圖2和圖3可知，ε-PL處理可顯著降低柑橘酸腐菌的孢子萌發率。圖2A1～A7為6 h時，200 倍的光學顯微鏡下，各組柑橘酸腐菌的孢子萌發情況，對照組的柑橘酸腐菌孢子萌發率較高，芽管伸長明顯，ε-PL處理組孢子萌發、芽管伸長受到明顯抑制。隨著ε-PL質量濃度的增加，對柑橘酸腐菌孢子萌發率顯著下降（P＜0.05），呈現出明顯的量效關系（圖2B）。由圖3可知，當ε-PL的質量濃度為200、400 mg/L和600 mg/L時，對柑橘酸腐菌菌絲體生長的抑制率分別為（52.42±1.40）%、（85.83±0.66）%與（92.63±0.38）%。經質量濃度800 mg/L的ε-PL處理后，能抑制99.50%以上的菌絲體生長，抑制率達（99.32±0.59）%，經質量濃度為400 mg/L與600 mg/L的ε-PL處理，對柑橘酸腐菌孢子萌發抑制率分別達到了（57.42±1.01）%和（84.80±1.01）%，與對照組差異顯著（P＜0.05），用質量濃度800 mg/L的ε-PL處理后，基本無孢子萌發。

圖3 ε-PL處理對柑橘酸腐菌的菌絲體生長和孢子萌發的抑制率Fig. 3 Mycelium growth and spore germination inhibitory rates of Geotrichum citri-aurantii by ε-PL treatment

表2 ε-PL對柑橘酸腐菌的毒力回歸方程和C50Table 2 Virulence regression equation and EC50 ofε-PL against Geotrichum citri-aurantii

表2 ε-PL對柑橘酸腐菌的毒力回歸方程和C50Table 2 Virulence regression equation and EC50 ofε-PL against Geotrichum citri-aurantii

95%置信區間/（mg/L）菌絲 Y＝2.785 8X-0.877 8 0.932 2 128.79 82.694 3～200.586 1孢子 Y＝2.839 8X-1.622 4 0.930 1 214.77 146.409 5～315.042 5指標 毒力回歸方程 決定系數R2 EC50/（mg/L）

由表2可知，ε-PL處理對柑橘酸腐菌菌絲體生長有抑制作用，其毒力回歸方程為Y＝2.785 8X-0.877 8，EC50為128.79 mg/L。ε-PL處理對柑橘酸腐菌對孢子萌發的毒力回歸方程為，Y＝2.839 8X-1.622 4，EC50為214.77 mg/L。

2.4 ε-PL處理對柑橘酸腐菌細胞膜通透性的影響

細胞膜為菌體的保護屏障，具有保護、識別、物質交換等功能，能使菌體細胞維持相對穩定的內環境[37-38]。當細胞膜的通透性發生變化，細胞膜的結構被破壞，細胞內的電解質滲漏到培養液中，致使培養液的電導率升高，相對電導率值的變化可以反映菌體細胞膜通透性的變化[39]。由圖4可知，對照組菌絲體的胞外相對電導率緩慢上升，至12 h時，相對電導率達（4.64±0.13）%。經過ε-PL處理的菌絲體的胞外相對電導率在培養過程中上升較快，且隨著ε-PL處理時間的延長與ε-PL質量濃度的增大，相對電導率增幅呈上升趨勢。至12 h時，經質量濃度為1×MIC和2×MIC的ε-PL處理，菌絲體的胞外相對電導率分別達（13.99±1.15）%、（35.82±0.64）%，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。本實驗表明ε-PL處理可引起柑橘酸腐菌細胞膜的通透性發生改變，使細胞膜喪失其正常的功能。

圖4 ε-PL處理對柑橘酸腐菌細胞膜通透性的影響Fig. 4 Effect of ε-PL treatment on cell membrane permeability of Geotrichum citri-aurantii

2.5 ε-PL處理對柑橘酸腐菌細胞成分釋放的影響

圖5 ε-PL處理對柑橘酸腐菌A260 nm細胞成分釋放的影響Fig. 5 Effect of ε-PL treatment on A260 nm of Geotrichum citri-aurantii

當菌體處于不利環境中時，其生長受到抑制，細胞結構被破壞，膜內的K+、PO43-等小離子物質會連同DNA、RNA等大分子物質泄漏[40]。因此，可通過測定260 nm波長處的吸光度來表征菌體經ε-PL處理后酸腐菌核酸等胞內物質的釋放情況。由圖5可知，在0～12 h內，經ε-PL處理后的酸腐菌菌絲體的胞外A260nm明顯增加，且始終高于對照組。處理12 h后，對照組的A260nm（0.215±0.001）顯著低于1×MIC處理組（0.445±0.002）以及2×MIC處理組（0.628±0.006）（P＜0.05）。1×MIC、2×MIC處理組260 nm波長處的吸光度隨著作用時間的延長呈現上升趨勢，1×MIC、2×MIC處理組的作用效果與ε-PL質量濃度正相關。說明ε-PL處理顯著增加了酸腐菌細胞成分的釋放，造成柑橘酸腐菌菌體內部的核酸等物質外泄，細胞內含物泄漏速率與ε-PL質量濃度呈正相關。

2.6 ε-PL處理對柑橘酸腐菌細胞膜完整性的影響

圖6 ε-PL處理對柑橘酸腐菌細胞膜完整性的影響Fig. 6 Effect of ε-PL treatment on membrane integrity of spores of Geotrichum citri-aurantii

熒光染料PI可用于檢測ε-PL是否引起細胞膜完整性喪失[41]。PI是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑，PI不能通過健康的活細胞膜，但能穿過破損的細胞膜與細胞中的DNA結合產生紅色熒光，在顯微鏡下觀察到發出紅色熒光的細胞已經死亡[42]。從圖6A可以看出，明場下觀察，對照組孢子長勢良好、結構完整，而ε-PL處理組的孢子細胞部分出現破裂，產生細胞碎片等溶出物；暗場（PI染色）下觀察，對照組孢子基本無紅色熒光，ε-PL處理組則顯現出較強的熒光，且熒光強度隨ε-PL質量濃度增加而增強，ε-PL處理能夠破壞酸腐菌孢子細胞膜的完整性。酸腐菌孢子失去細胞膜完整性的比例與ε-PL質量濃度呈正相關，當用質量濃度為1×MIC（400 mg/L）、2×MIC（800 mg/L）的ε-PL處理6 h后，分別有約（13.46±0.47）%、（31.29±0.78）%的酸腐菌孢子細胞膜完整性喪失（圖6B）。

2.7 掃描電子顯微鏡觀察ε-PL處理對柑橘酸腐菌菌絲體形態的影響

改變病原菌菌絲體形態是殺菌劑及抑菌活性物質重要的作用途徑之一，抑菌劑可使菌絲呈多種畸形變化甚至斷裂，從而阻礙其正常的生長發育。由圖7可知，ε-PL處理對柑橘酸腐菌絲體形態存在明顯影響。對照組菌絲飽滿表面光滑、結構完整、形狀規則、隔膜明顯，處于正常生長狀態。而經1×MIC和2×MIC處理的柑橘酸腐菌菌絲體發生多種形態變化。1×MIC處理組的菌絲體表面粗糙、出現皺縮變形。相比之下，2×MIC處理組的菌絲體形態變化更為劇烈，菌絲體表面嚴重褶皺、膨大凸起、整體扭曲變形、菌絲斷裂，從而使細胞內容物質泄漏，這與ε-PL處理對柑橘酸腐菌細胞膜的影響部分結果一致。ε-PL處理對柑橘酸腐菌菌絲體具有損傷作用。

圖7 柑橘酸腐菌掃描電子顯微鏡圖Fig. 7 SEM images of Geotrichum citri-aurantii

2.8 ε-PL處理對柑橘果實酸腐病的防治效果

從圖8 A、B 可知，貯藏8 d 后，對照組發病率達（9 8.3 3±2.8 9）%，柑橘果實病斑直徑達（39.33±1.53）mm。與對照組相比，ε-PL處理能有效控制柑橘果實酸腐病的發生，達到了一定的防治效果。增加ε-PL的質量濃度可以有效地減小柑橘果實的病斑直徑（P＜0.05），控制效果隨ε-PL質量濃度的增加而增強。用1 600 mg/L的ε-PL處理柑橘果實后，病斑的生長直徑明顯減小，當ε-PL的質量濃度達到6 400 mg/L時，病斑直徑減小到（5.24±0.29）mm，發病程度明顯減輕。采用1 600、3 200 mg/L和6 400 mg/L ε-PL處理柑橘果實，發病率分別顯著降低到（83.33±2.89）%、（55.00±5.00）%和（21.67±2.89）%（P＜0.05）。因此，ε-PL處理對柑橘采后酸腐病的發生有一定的防治效果。圖8C表明貯藏8 d同孔接種不同質量濃度ε-PL的柑橘果實病斑直徑的擴展情況。可以看出，與對照組相比，隨著ε-PL質量濃度的增加柑橘果實酸腐病的病斑直徑擴展被抑制，質量濃度為6 400 mg/L時處理效果最好。

圖8 ε-PL處理對柑橘果實酸腐病發病率和病斑直徑的影響Fig. 8 Effect of ε-PL treatment on sour rot incidence and lesion diameter of citrus fruit

3 討 論

本實驗探討了不同質量濃度的ε-PL對柑橘酸腐菌的抑制作用。體外實驗表明ε-PL對柑橘酸腐菌具有良好的抑制作用，ε-PL對柑橘酸腐菌的MIC為400 mg/L，對菌絲體生長和孢子萌發抑制的EC50分別為128.79 mg/L和2 1 4.7 7 m g/L，當ε-P L 的質量濃度為2×M I C（800 mg/L）時，對菌絲生長和孢子萌發抑制率分別為（99.88±0.20）%和（99.32±0.59）%，基本抑制了孢子的萌發，菌絲體發生扭曲、斷裂現象，生長繁殖受阻。這與Liu Kewei等[24]研究發現ε-PL處理對粉紅單端胞霉菌的孢子萌發以及菌絲體生長具有抑制作用的研究結果一致。在活體實驗中，當ε-PL質量濃度達到1 600、3 200、6 400 mg/L時能顯著降低酸腐病的發病率與果實病斑的生長直徑，減輕酸腐病的發病程度，各處理組與對照組差異顯著（P＜0.05），可有效控制柑橘酸腐病的發生。Li Hua等[19]的研究結果表明，ε-PL處理可以有效防治紅棗采后灰霉病的發生，這與本實驗的研究結果具有一致性。離體和活體實驗均能說明ε-PL對柑橘酸腐菌有著較好的抑制作用。

細胞膜是細胞與周圍環境進行物質交換和信息傳遞的通道和屏障，它的通透性和完整性在細胞進行正常生理活動中具有重要的作用，細胞膜是常見的抗真菌劑的重要作用靶標[31,43]。據相關研究報道ε-PL具有多價陽離子特性，可對微生物細胞表面產生靜電吸附作用，破壞微生物的細胞膜結構，引起細胞物質、能量與信息傳遞中斷，抑制微生物的生長繁殖[19,44]。本實驗也存在類似的研究結果，當添加1×MIC和2×MIC的ε-PL后，酸腐菌菌絲體胞外相對電導率與260 nm波長處的吸光度都有顯著上升（P＜0.05）。相對電導率增加與細胞膜通透性異常變化有關。抑菌劑作用于細胞膜后，使細胞質離子穩態遭到破壞，電解質泄漏、電導率上升，損壞了細胞質膜的屏障，影響菌體的代謝繁殖。Su Ruihua等[45]研究發現經ε-PL處理后的蠟狀芽孢桿菌培養液電導率會增大、菌體細胞裂解率增加，Zhang Xiaowei等[21]用ε-PL處理大腸桿菌O157:H7后，發現處理組的大腸桿菌O157:H7細胞膜通透性發生改變，細胞內含物外滲，本實驗也得到相似的結果。在0～12 h內，ε-PL作用于柑橘酸腐菌細胞，引起細胞膜通透性異常變化，造成細胞內外滲透壓失衡，K+、Mg2+、Ca2+等小分子物質滲出、胞外離子含量升高，相對電導率增加，1×MIC、2×MIC的ε-PL處理組顯著高于對照組（P＜0.05），相對電導率增加是ε-PL處理對病原菌產生損傷作用的早期表現。260 nm是核酸的特征波長，在處理12 h后，隨著ε-PL質量濃度升高與作用時間延長，A260nm顯著升高，說明外源性的ε-PL與菌體細胞膜結合后，改變了細胞膜的結構，導致細胞質流失、引起胞內核酸等大分子物質泄露。通過激光共聚焦顯微鏡觀察酸腐菌孢子核酸熒光染色，結果表明1×MIC、2×MICε-PL作用后的柑橘酸腐菌紅色熒光信號明顯高于對照組（P＜0.05），進一步證實了ε-PL對細胞膜的損傷作用與抑菌活性。這一結果與Tan Zhilei等[22]研究報道的ε-PL處理對金黃色葡萄球菌細胞膜的損傷作用及Wei Lianhua等[46]關于ε-PL處理對白色念珠菌細胞膜完整性的破壞作用的結論一致。掃描電子顯微鏡觀察結果表明，ε-PL處理后酸腐菌菌絲體的形態結構發生褶皺、腫大畸形、斷裂、內容物外泄等裂解現象，這與Liu Kewei等[24]研究發現ε-PL處理對指狀青霉菌菌絲體形態結構具有損傷作用的研究結果具有一致性。因此，ε-PL具有抑菌作用，其可能是通過破壞菌體細胞膜結構導致內容物外泄，進而影響細胞的生長代謝或造成細胞死亡，從而抑制其生長。一些抑菌活性成分也有相似的抑菌作用機制，如α-水芹烯及壬醛對圓孤青霉菌的抑菌機制[47]與檸檬醛對柑橘酸腐菌的抗真菌機制可能是破壞細胞膜的完整性和引發細胞成分的泄漏[8]，α-松油醇對意大利青霉的抑制作用也表現出相似的抑菌機制[48]。

4 結 論

實驗結果表明，質量濃度800 mg/L的ε-PL對菌絲生長和孢子萌發抑制率分別為（99.88±0.20）%和（99.32±0.59）%，可有效抑制柑橘酸腐菌的菌絲體生長，延緩病原菌孢子萌發。質量濃度為1 600、3 200、6 400 mg/L的ε-PL能顯著降低柑橘果實酸腐病的發病率與病斑直徑（P＜0.05）。ε-PL通過破壞柑橘酸腐菌細胞膜的結構，使其通透性增加、完整性喪失，對細胞膜的穩定性及細胞內環境造成一定的影響，引起細胞破損胞內物質外滲溢出，進而抑制了菌體細胞的生長與繁殖。ε-PL能抑制柑橘酸腐菌的生長，可用于柑橘采后酸腐病的防治，有望開發成環境友好復合型的新型保鮮劑，本實驗為柑橘果實采后酸腐病的控制提供了理論依據。