以‘紅巴拉多’為母本的胚挽救育種研究

張曉涵，田淑芬*，張娜

（1. 天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2. 天津市農業科學院果樹研究所，天津 300381；3. 天津農學院，天津 300384）

無核鮮食葡萄由于其食用方便、口感獨特，受到了世界各地消費者的喜愛。1995年，董新平[3]利用赤霉素處理有核葡萄的花序，出現了無核性狀的葡萄。相較于二倍體葡萄來說，三倍體葡萄無核、果粒大，食用方便方面更具優勢[1]，是育種工作者培育無核葡萄的主要途徑之一。三倍體葡萄在培育的過程中往往會發生胚的敗育現象，而不能正常結實。胚挽救育種是獲得三倍體無核葡萄的主要方法[2-5]，利用胚挽救技術可提高后代雜交胚的成活率。1993年，山下用四倍體和二倍體雜交，取其雜交胚進行人工培養獲得了三倍體的試管苗，但并未對雜交株進行進一步的結實研究。目前，成功培育出的三倍體葡萄品種有‘夏黑’（Summer Black）、‘尾玲’（Yileyi）、‘蜜無核’（Honey Seedless）、‘早紅’（Earlyred Seedless）等[6-8]。二倍體葡萄‘紅巴拉多’是極早熟的歐亞雜種，具有皮薄肉脆、果穗大、不掉粒的特點[9]。本試驗以其為母本，四倍體葡萄‘戶太八號’‘巨玫瑰’為父本培育三倍體葡萄，探究不同的取樣時期、胚發育天數及不同父本對其胚挽救結果的影響，提高雜種胚后代的發育率和萌發率，以獲得無核、大粒、耐貯運的葡萄新品種。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗親本選自天津市農業科學院現代農業創新基地，于2015年定植。試驗于2019年3月開始在天津市農業科學院現代農業創新基地、天津市葡萄遺傳與育種企業重點實驗室進行。親本倍性及雜交組合如表1所示。

表1 胚挽救雜交組合及親本倍性Table 1 Embryo rescue hybrid combination and ploidy of parents

1.2 方法

1.2.1 田間雜交

于2019年4月進行父本花粉的采集，待大部分花穗中的小花蕾開放5%左右時，將其整穗剪下并用鑷子剝取花藥。待花藥自然陰干后加入干燥劑（變色硅膠）放入4 ℃冰箱保存備用。在母本‘紅巴拉多’開花前3～4 d進行人工去雄，每種組合雜交10穗。于去雄后第2天開始授粉，連續授粉3 d。每次授粉后的花穗套袋，并標注雜交組合及授粉時間。

1.2.2 幼果采集與消毒

雜交幼果于授粉后45 d、52 d、59 d和66 d分別取樣，共計4次。將采下的幼果去除果柄，用洗潔精清洗果實表面后放入流水中沖洗10 min，沖洗過的幼果置于超凈工作臺進行消毒，先用75%酒精浸泡30 s，用無菌水沖洗3次，再放入2%次氯酸鈉中浸泡3 min，用無菌水沖洗3次。

1.2.3 胚珠的發育培養

將雜交幼果置于超凈工作臺中，用解剖針將胚珠取出，接種在發育培養基（Nitsch＋1.5mol/L IAA＋0.5 mol/L 6-BA＋0.5 mol/L GA3）中，并添加60 g/L蔗糖、5 g/L 瓊脂和1 g/L 活性炭，調pH至5.8。

1.2.4 胚的萌發培養

在胚珠發育培養60、90、120 d后，進行胚的萌發培養，用解剖針剝取胚接種到萌發培養基（WPM＋0.2 mg/L 6-BA）中并添加30 g/L蔗糖、5 g/L瓊脂及1.5 g/L活性炭進行發育培養，調pH為5.8。培養30 d后進行數據統計，統計方法如下：

胚發育率/%＝(發育胚數/接種胚珠數)×100胚萌發率/%＝(萌發胚數/接種胚珠數)×100采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析（P＜0.05）

2 結果與分析

2.1 不同取樣時期對胚挽救結果的影響

如表2所示，發現‘紅巴拉多’ב戶太八號’的雜交胚在45 d取樣時胚發育率最高，胚發育率在52 d最高達到25%，胚發育率在66 d最高為11%。而‘紅巴拉多’ב巨玫瑰’雜交胚的發育率和萌發率都在授粉后59 d取樣達到最高分別為26%和14%。

2.2 胚發育培養天數對胚萌發率的影響

試驗中將胚分別發育培養60 d、90 d、120 d，觀察其胚萌發率，如表3所示。結果發現‘紅巴拉多’ב戶太八號’的雜交胚在培養90 d時胚萌發率高于其他兩個時期，而‘紅巴拉多’ב巨玫瑰’雜交胚達到最大胚萌發率的培養天數較長，為120 d。

2.3 不同父本對胚挽救結果的影響

從表4中可以看出，以‘紅巴拉多’為母本，通過對比胚發育率和萌發率，‘巨玫瑰’要比‘戶太八號’對于母本的親和性高，雜種胚生命力強，胚發育率及萌發率可分別達到26%和14%。但‘紅巴拉多’ב戶太八號’形成的胚珠數量明顯高于‘紅巴拉多’ב巨玫瑰’。

表 2 不同取樣時期對胚挽救結果的影響Table 2 Effect of different sampling time on embryo rescue

表 3 不同胚培養天數對胚萌發率的影響Table3 Effect of different training dates on germination emberyo

表4 不同父本對胚挽救結果的影響Table 4 Effect of different male parent genotypes on embryo rescue

3 討論與結論

獲得三倍體無核葡萄最有效的方法是通過二倍體與四倍體葡萄雜交。在二倍體與四倍體的雜交實驗中，以二倍體為母本的組合，胚珠萌發率普遍高于以四倍體為母本的組合[10-12]。由于不同倍性父母本的遺傳背景不同，導致其具有遺傳差異，因而導致雜交障礙[13]，會使雜種胚在未成熟前發生敗育，胚挽救技術是克服這一障礙的有效手段，從而獲得大量的雜交后代。雜交胚珠的取樣時期是胚挽救成功的重要因素，郭修武等[14-15]發現最佳取樣時期與母本成熟期有很大關系。本試驗以二倍體葡萄‘紅巴拉多’為母本，發現當父本為‘戶太八號’時獲得的胚珠數量較多，且在授粉后45 d胚發育率最高，但萌發率為0，其原因可能是由于胚發育不夠成熟，過早取樣的胚生命力弱導致其不能萌發。‘紅巴拉多’ב巨玫瑰’的雜交胚在授粉后59 d時接種，胚發育率和萌發率都是最高，為其最佳的取樣時間。因此推測不同父本對取樣時間也有一些影響，這與徐海英等[11,16]的結果有差異，還需進一步研究。除取樣時期外，胚的發育天數對胚的萌發率也有一定影響。本試驗研究表明，‘紅巴拉多’ב戶太八號’的雜交胚，胚發育培養90 d時的胚萌發率明顯高于其他兩個時期，為最佳的胚發育培養時間。‘紅巴拉多’ב巨玫瑰’的雜交胚，胚萌發率隨培養天數的增加呈遞增趨勢，其最佳胚發育培養天數還有待進一步研究。