混合菌株順序發酵對葡萄酒質量的影響

孔祥君，任同同，許維娜,3*

（1. 煙臺邁百瑞國際生物醫藥有限公司，山東煙臺 264006；2. 濱州醫學院藥學院（葡萄酒學院），山東煙臺264003；3. 煙臺張裕集團有限公司/山東省葡萄酒微生物發酵技術重點實驗室，山東煙臺 264001）

混菌發酵是指利用兩種或兩種以上的微生物，聯合完成某種發酵過程的新型技術，是在單菌株純培養發酵技術上的創新[1]。在葡萄汁發酵為葡萄酒的過程中，不同酵母菌發揮的作用是不同的，通?；炀l酵能使發酵產品表現出更好的特性[2]。多酵母混合發酵可利用菌株之間的協同作用，使發酵底物的利用率增高、發酵產率提高，并可產生、增強一些有益風味的化合物，如酯類、揮發性酚類等，或者降解某些不良氣味物質如乙醛、乙酸等，從而改善葡萄酒的風味特征，使發酵酒風味更加豐富、濃郁[3-6]?；炀l酵并不是幾種酵母菌株的隨意組合，要選擇在發酵中能產生明顯互利互補作用的菌株。此外，各種酵母菌株的接種比例和接種順序也會對發酵酒質量產生影響，例如，趙芳琴等[7]發現將梅奇酵母（Mstschnikowia）和釀酒酵母（Saccharomyces）按1∶1的接種比例進行混菌發酵，可有效提升‘美樂’低醇葡萄酒的香氣品質；許維娜等[9]發現，速度型釀酒酵母與風味型釀酒酵母接種比例為1∶4時，葡萄酒的香氣更加豐富、濃郁，酒的感官質量最好；曾朝珍等[9]研究發現，先接種異常漢遜酵母24 h后接種釀酒酵母，發酵的蘋果白蘭地風味物質最復雜，品質及風味最好。

目前，針對葡萄酒混菌發酵的研究多采用釀酒酵母與非釀酒酵母 [如有孢圓酵母（Torulaspora）、梅奇酵母、有孢漢遜酵母（Hanseniaspora）、隱球酵母（Cryptococcus）、畢赤酵母（Pichia）、假絲酵母（Candida）等] 混合發酵[4-6,10]，但很多非釀酒酵母的發酵產品存在一些食品安全隱患[8]，采用不同種類、優勢互補的釀酒酵母進行混菌發酵，將獲得更安全的產品。

本研究采用兩株野生釀酒酵母，即速度型發酵酵母和風味型發酵酵母進行混合發酵，將兩酵母按照不同的順序接種到葡萄汁中，通過比較分析各發酵液樣品的基礎理化指標、風味物質含量、感官質量得到最優的菌株接種順序，從而探索較佳的混菌發酵工藝，釀造出具有更高品質的葡萄酒。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

釀酒酵母S2，速度型發酵菌株，分離自煙臺大柳行葡萄基地；釀酒酵母F6，風味型發酵菌株，分離自平度大澤山某葡萄基地；釀酒葡萄‘蛇龍珠’取自煙臺蓬萊某葡萄園，壓榨取汁。葡萄汁的總糖220 g/L，pH 3.57，總酸5.8 g/L。

表1 兩種酵母的接種量與接種時間Table 1 Inoculation volume and time of two yeasts/(cfu/mL)

1.2 主要試劑和設備

葡萄糖、瓊脂、氫氧化鈉、斐林A液、斐林B液，國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨、酵母粉，英國OXFID公司；鹽酸、NaCl試劑，天津市科密歐化學試劑有限公司；3-辛醇，山東天海有限公司。

UV1800紫外分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海力辰邦西儀器有限公司；TSQ8000Evo氣相色譜-質譜聯用儀，美國Thermo公司；附溫度計密度瓶，上海壘固儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母種子液制備與濃度測定

將斜面保藏的釀酒酵母S2和F6分別單獨接種到配置好的新鮮YEPD液體培養基中，25 ℃恒溫震蕩培養24 h進行活化，按5%接種至葡萄汁中，再25 ℃恒溫震蕩培養24 h，重復2次得到種子液。

酵母種子液適度稀釋后，用紫外分光光度法測定其吸光度值（OD600）。酵母菌濃度的計算公式：酵母菌濃度/(cfu/mL)＝OD600×稀釋倍數×107，以此為依據計算接種量。

1.3.2 接種與發酵

酵母菌S2與F6的接種比例為1∶1，接種總菌濃度為2×106cfu/mL。共設6個試驗組，接種方法如表1所示。設置同時接種組（處理1、2）、優先接種速度型發酵菌組（處理3、4）、優先接種風味型發酵菌組（處理5、6）。每個試驗設3個平行，24～26 ℃進行發酵。

發酵開始后，每天檢測比重、CO2失重量，待上述指標基本穩定，不再發生變化時結束發酵。將發酵液過濾澄清后進行倒罐。

1.3.3 發酵液基本理化指標檢測

發酵完成倒罐澄清后獲得發酵液進行理化指標檢測?？偺桥c還原糖測定采用斐林滴定法，總酸的測定采用酸堿滴定法，酒精度的測定采用密度瓶法[11]。

1.3.4 發酵液香氣成分檢測

發酵液中香氣物質成分分析采用固相微萃取-氣相色譜/質譜法（HS-SPME-GC/MS）[12-14]。從各酒樣中分別吸取5 mL放入萃取瓶中，添加1.5 g氯化鈉、200 μL濃度為100 mg/L的3-辛醇，45 ℃水浴平衡30 min。將進樣器萃取針插入瓶內萃取50 min，待吸附平衡后將進樣器插入氣相色譜進樣口解析10 min，開始GC-MS檢測。GC條件為：載氣He；流速1.2 mL/min；分流進樣，進樣比1∶1.5；進樣量10 μL；檢測器溫度250 ℃；進樣口溫度250 ℃。MS條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，質量掃描范圍30～500 m/z。

分離到的香氣成分質譜數據結合計算機圖譜庫NIST11、相同色譜條件下該物質的標準曲線進行定量分析，采用3-辛醇做內標物質。再根據樣品保留時間確認每個香氣物質的化學成分。對于沒有標準化合物的定性目標峰，采用與目標香氣物質化學結構和分子量相近的化合物的標準曲線計算，得出的峰面積與3-辛醇面積進行對比，得到其質量濃度。

1.3.5 感官評價

參照GB 15038-2006中的香氣評判方法[15]，由13名品酒員組成品評小組對發酵液進行外觀、香氣、口感三個方面的綜合感官評價，其中外觀包括澄清度和掛杯（10分）、色澤（10分），香氣包括香氣特性（20分）、協調性（20分），口感包括口感特性（20分）、協調性（20分）。

表2 發酵樣品理化指標Table 2 Physicochemical indexes of fermented samples

2 結果與分析

2.1 理化指標分析

各發酵液樣品的總糖、還原糖、總酸和酒精度測定結果如表2所示。所有發酵樣品的殘糖均在3.17～3.83 g/L，總酸在4 g/L左右，酒精度在12.08%～12.67%?？傮w而言，同時接種組和優先接種速度型發酵菌組發酵效率略高。

2.2 香氣物質檢測結果

通過HS-SPME-GC/MS的方法對樣品中香氣物質進行分析，共檢測出36種香氣成分，大致分為酯類（19種）、酸類（9種）、醇類（6種）、醛類（2種）4大類。不同酒樣所含的香氣物質的種類和含量均有差異。

酯類化合物是葡萄酒中重要的揮發性有機物質，其比例協調對葡萄酒香氣有正增效作用[16-17]。如表3所示，6個樣品中共有19種酯類物質被檢出，其中處理1～6各檢出11、10、11、11、11、9種。癸酸乙酯、9-癸酸乙酯、辛酸乙酯、十二酸乙酯在各樣品中的含量相對較高，它們都主要呈現花果香氣，其中含量最高的癸酸乙酯貢獻果香香氣[18-19]。酯類物質總含量最高的為處理3，其次為處理5、6、4，同時接種組（處理1、2）的酯類物質含量相對較低。

酸類物質主要使葡萄酒呈現出一些粗糙、不愉悅的氣味，然而，它能抑制芳香酯的水解，并起到平衡酒體的重要作用，因此對于香氣平衡具有重要作用[20]。如表4所示，6個樣品中共有9種酸類物質被檢出，處理1～6各檢出8、3、6、5、4、4種，酸類物質種類與含量最高的為處理1。各發酵液樣品中含量較高的酸類有辛酸、月桂酸、癸酸，主要賦予葡萄酒水果香氣、月桂油味等氣味[21]。整體而言，各樣品中酸類物質含量較低（低于20 mg/L），會對葡萄酒香氣產生良好的影響[8]。

表3 酒樣中酯類物質含量Table 3 Contents of esters in wine samples/(mg/L)

表4 酒樣中酸類物質含量Table 4 Contents of acids in wine samples/(mg/L)

葡萄酒中的醇類物質來源于葡萄漿果或在酒精發酵期間產生[22]。高級醇主要為葡萄酒貢獻植物類香氣，適當濃度的高級醇能夠增加葡萄酒香氣的復雜度和協調性，使酒體醇厚、豐滿[23]。如表5所示，6個樣品中共有6種醇類物質被檢出，其中處理1～6各檢出6、4、6、5、4、4種。各發酵液樣品中含量較高的醇類為苯乙醇和3-甲基丁醇，分別呈現花香味和燒焦味、酒精味[19]。醇類物質種類與含量較高的為處理1、3、5?？傮w而言，第1天＋第2天接種（處理1、3、5）的樣品醇類含量略高于第1天＋第3天接種（處理2、4、6）的組別。

如表6所示，6個發酵液樣品中有2種醛類物質被檢出，為壬醛和癸醛，分別賦予葡萄酒玫瑰、柑橘香和甜香、花香[21]，以處理5中含量略高（主要為壬醛），其他樣品中含量均較低。

表5 酒樣中醇類物質含量Table 5 Contents of alcohols in wine samples/(mg/L)

表6 酒樣中醛類化合物含量Table 6 Contents of aldehydes in wine samples/(mg/L)

圖1 各酒樣的感官分析結果Figure 1 Results of sensory analysis

2.3 感官品評結果

各酒樣的感官品評結果如圖1所示。結合外觀、香氣和口感指標，綜合評分由高到低依次是處理3、5、1、2、4、6。先接種速度發酵酵母S2、較風味發酵菌F6提前1 d的處理3所得酒樣的果香和發酵香更加明顯，香氣和口感更加平衡，得分最高。綜合而言，各樣品間感官指標差異較小，采用第1天+第2天接種（處理1、3、5）的實驗組感官表現略好于第1天+第3天接種（處理2、4、6）組別。

3 討論與結論

本研究將速度發酵酵母與風味發酵酵母按照不同的順序接種到‘蛇龍珠’葡萄汁中進行發酵，通過對發酵液理化指標、香氣物質、感官指標的比較，探索混菌發酵中接種順序對發酵酒質量的影響。結果表明，同時接種組和優先接種速度型發酵菌組發酵效率略高；優先接種速度型發酵菌組和優先接種風味型發酵菌組酯香物質含量較高。感官品評結果表明，采用第1天＋第2天接種的試驗組感官表現略好于第1天＋第3天接種組別，處理3樣品果香和發酵香明顯，香氣和口感協調，得分最高。綜合分析認為，在混菌順序發酵過程中，采用處理3的方法，即先接種速度發酵酵母S2、第2天再接種風味發酵菌F6，所得到的發酵酒質量最好。曾朝珍等[9]同樣發現適宜的混菌發酵接種順序可提高酯類、醇類物質含量，提高蘋果白蘭地的品質及風味；袁曉龍等[24]的鴨梨酒工藝實驗也證實混菌發酵的接種順序對發酵酒基礎理化指標、感官指標有一定影響。因此，混菌發酵過程中接種順序是影響發酵酒質量的重要因素之一，適當的接種順序有助于獲得高品質的發酵產品。

混菌發酵對提升葡萄酒質量、突出葡萄酒個性有重要意義。本試驗采取的混菌發酵方式是以不同順序接種兩種釀酒酵母，探究較佳的發酵方式，接下來也可以在單因素實驗的基礎上，進一步探索接種順序和接種比例優化的復合效果，探索最優的混菌發酵工藝。