高效液相色譜法在牛乳整體蛋白檢測中的應用

陳江

摘 要：蛋白質(zhì)含量是牛乳及其乳制品質(zhì)量評價的一項主要指標。本文對疏水相互作用色譜、反相色譜技術(shù)在牛乳整體蛋白含量測定方面的研究進展做了簡要的介紹和評述，也對未來的發(fā)展提出了一些建議。

關(guān)鍵詞：牛乳;蛋白質(zhì);高效液相色譜法

1 應用液相色譜法分離牛乳及其乳制品中的蛋白

1.1 疏水相互作用色譜（HIC）

HIC是利用鹽水體系中不同蛋白的疏水殘基與填料疏水性配基相互作用力的不同而進行分離的一種方法，固定相的疏水性適中。其梯度洗脫的弱洗脫劑是高濃度鹽的緩沖液，而強洗脫溶液是低鹽濃度的緩沖溶液，通常是在pH值為6～8條件下進行分離的。

文獻[1]利用疏水色譜柱在快速蛋白液相色譜系統(tǒng)下，分析了β-酪蛋白、αs2-酪蛋白、αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白與γ-酪蛋白5種酪蛋白的含量，其中γ-酪蛋白是β-酪蛋白的水解產(chǎn)物變種，但該方法并未分開γ-酪蛋白和αs2-酪蛋白。當調(diào)整pH值并改善緩沖液后，分離了4種乳清蛋白：β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白和免疫球蛋白。文獻[2]用TSK疏水色譜柱對α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白進行了分析，流動相為磷酸鹽緩沖液和高濃度的變性劑脲，用硫酸銨梯度洗脫，對全脂奶粉和脫脂酸奶進行了分析測定。在實際樣品中分析酪蛋白主要有兩個困難：酪蛋白在水中溶解度低;乳清蛋白的干擾[2]，文獻[1-2]中很好的解決了這個問題，表明了TSK柱是定性定量分析實際樣品很好的工具，結(jié)果準確，重現(xiàn)性好，在檢測乳制品酪蛋白含量具有獨特的優(yōu)勢。

1.2 反相液相色譜（RPLC）

RPLC是公認的HPLC中分離度最高，應用范圍最廣的液相色譜分析方法。它是基于蛋白質(zhì)分子的疏水性的不同而實現(xiàn)分離的，與HIC相比，RPLC固定相的非極性更強。文獻[3]通過實驗發(fā)現(xiàn)對分別經(jīng)鹽酸胍和脲處理后的樣品進行立即分析，二者具有相似的分離效果，但在放置8.5 h以后，發(fā)現(xiàn)用脲處理的樣品的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分離度降低。同時也發(fā)現(xiàn)用二硫蘇糖醇處理樣品要比β-巰基乙醇更能改善這兩種蛋白的分離效果。文獻[4]又在預處理培養(yǎng)液中加入了Bis-tris緩沖液，離心去脂后得到了澄清溶液，用碳18反相柱分析了αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白6種蛋白。文獻[5]中第一次實現(xiàn)對大豆蛋白和動物乳清蛋白之間的相互分離，為乳中摻假廉價植物蛋白的檢測提供了參考依據(jù)。王娟[6]用安捷倫C8色譜柱分析了牛奶中αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、乳清蛋白和免疫球蛋白，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，用外標法測定回收率在75%～132%。RPLC法的優(yōu)點是分離度高，與HIC法相比，速度更快，是目前應用最廣的檢測牛奶蛋白質(zhì)的方法。

2 展望

牛奶的營養(yǎng)成分以酪蛋白為主。從戰(zhàn)略上講，直接測定各種營養(yǎng)蛋白的含量要比間接測定更科學。而測定牛奶中一種或幾種特征營養(yǎng)蛋白要比測總蛋白更好，不僅能充分了解牛奶營養(yǎng)成分的實際情況，而且可從根本上杜絕向牛奶中加入非法添加物的行為。

用同時具有分離和定量功能的高效液相色譜法可實現(xiàn)分別測定這些蛋白這一目標。HIC法和RPLC法相比，以RPLC效果更好，應用也最廣泛。然而分析時間太長，難以滿足批量奶樣的現(xiàn)場快速檢測需求，必須發(fā)展快速HPLC法及快速樣品預處理法。快速必然會導致測定準確度的降低，可采用“BioCop”策略[7]中的“生物標記和指紋識別”概念，測牛奶中蛋白特征的“指紋圖譜”，在識別是否牛奶中有無“非法的添加物”的同時，實施對牛奶中該特征蛋白指紋圖譜中每一種蛋白的定量測定。

參考文獻

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[2]Bramanti E， Ferri F， Raspi G， et al. New method for separation and determination of denaturedcaseins by hydrophobic interaction chromatography[J].Talanta，2001，54： 343-349.

[3]G.Bobe，D.C.Beitz，A.E.Freeman，G.L.Lindberg.Sample Preparation Affects Separation of Whey Proteins by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography[J].J Agric Food Chem，1998，46： 1321-1325.

[4]G.Bobe， D.C. Beitz， A.E. Freeman， G.L. Lindberg.Separation and Quantification of Bovine Milk Proteins by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography[J]. J.Agric Food Chem，1998，46： 458～463.

[5]M.C.Garcia，M.L.Marina，M.Torre.Simultaneous Separation of Soya Bean and AnimalWhey Proteins by Reversed-PhaseHigh-Performance Liquid ChromatographyQuantitative Analysis in Edible Samples[J].Anal Chem， 1997，69：2217-2220.

[6]王娟，張慶合，王志華，等.反相高效液相色譜法同時測定鮮牛乳中的乳清蛋白[J].分析化學，2009，37：1667-1670.

[7]C.Elliott D. Rutledge. Trends in Analytical Chemistry[J]，2010，29（11）：1237-1238.