金黃色葡萄球菌的耐藥現狀和耐藥基因的分析

程 聰，李春英，趙淑芳，祝力騁

（1.麗水學院職業技術學院，浙江麗水323000；2.麗水學院醫學與健康學院，浙江麗水323000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是革蘭陽性菌的代表，是臨床上常見的病原菌，可引起嚴重感染，廣泛分布于人體皮膚、黏膜及醫院環境中。近年來隨著各種開創性操作的迅猛開展及抗菌藥物廣泛應用，使該菌耐藥率不斷上升[1]，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的出現，須引起臨床高度重視[2]。為此，筆者對麗水學院附屬第一醫院2018年6月—2018年12月及2015年1月—2015年12月分離得到的金黃色葡萄球菌的耐藥現狀和耐藥基因的流行分布情況進行分析研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2018年6月—2018年12月及2015年1月—2015年12月麗水學院附屬第一醫院各科室送檢的感染性標本共212株，其主要來源于痰液、分泌物、尿液、血液、引流物等。細菌的分離鑒定參照《全國臨床檢驗操作規程》進行，并經法國生物梅里埃公司（bioMerieux）Vitek60細菌鑒定儀鑒定。質檢菌株金黃色葡萄球菌［ATCC29213］為實驗室保存。

1.2 儀器與試劑

Mueller－Hinton Agar瓊脂（Oxoid公司），藥物紙片（杭州濱和微生物試劑有限公司產品），PCR試劑（購于寶生物工程（大連）有限公司）；Vitek60型全自動細菌分析儀（法國生物梅里埃公司），PCR擴增儀（美國伯樂公司），凝膠成像儀（美國伯樂公司）。

1.3 藥敏試驗

藥敏試驗采用K-B法和瓊脂稀釋法，嚴格按照CLSI標準判讀藥敏結果，并采用標準菌株金黃色葡萄球菌［ATCC29213］實現質量控制。

1.4 細菌DNA提取

采取經典堿裂解法提取樣本DNA，將各臨床分離菌株及質控菌株接種于普通瓊脂平板，37℃培養24 h，取單菌落置入1.5 mL的Eppendorf離心管內（內預置生理鹽水200 μL），混勻，12 000 r/min離心5 min；棄上清，加入裂解液，混勻，100℃，10 min；10 000 r/min離心1 min；上清液為 DNA模板，-20℃冰箱保存備用。

1.5 耐藥基因檢測

根據PCR儀和試劑盒說明書進行操作，PCR反應參數：ermA、tetM：94℃預變性5 min，93℃變性40 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 40 s；ermB、tetK：94 ℃預變性 5 min，93 ℃變性 40 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸40 s；ermC：94 ℃預變性 5 min，93 ℃變性 40 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 40 s；aac（6'）：95 ℃預變性 5 min，94℃變性 40 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 40 s；mecA：94℃預變性 5 min，94℃變性 40 s，58℃退火 45 s，72℃延伸40 s；qacA：94℃預變性5 min，94℃變性40 s，60℃退火45 s，72℃延伸40 s。循環30次，72℃延伸10 min，10℃10min，結束。PCR擴增引物[3-4]由上海桑尼生物科技有限公司合成，基因引物見表1。

表1 耐藥基因擴增引物

2 結果

2.1 212株金黃色葡萄球菌標本來源分布

金黃色葡萄球菌標本來源主要為痰液，詳見表2。

表2 212株金黃色葡萄球菌標本來源構成比

2.2 212株金黃色葡萄球菌標本臨床科室來源構成比

金黃色葡萄球菌醫院感染主要集中在外科、兒科和骨科等科室，詳見表3。

表3 212株金黃色葡萄球菌標本臨床科室來源構成比

2.3 212株金黃色葡萄球菌藥敏實驗結果

藥物敏感試驗顯示金黃色葡萄球菌對青霉素耐藥率最高，其次為苯唑西林；對呋喃妥因的耐藥率最低，稍高的為奎奴普丁/達福普汀。與2015年相比，2018年金黃色葡萄球菌對大多數抗菌藥物的耐藥率有不同程度的下降，詳見表4。

表4 212株金黃色葡萄球菌藥敏率

2.4 耐藥基因

本研究顯示，金黃色葡萄球菌耐藥基因以mecA為主（76/212），檢出率為35.85%，其次為ermA（41/212），檢出率為19.34%，只攜帶一種耐藥基因的有93株菌，攜帶兩種耐藥基因的有27株菌，且以mecA/ermA組合最常見（21/27），攜帶3個耐藥基因的有4株菌，都攜帶mecA、ermA和ermC基因，詳見表5。

表5 金黃色葡萄球菌耐藥基因及檢出率

3 討論

金黃色葡萄球菌是目前臨床感染性疾病的主要致病菌之一，可引起全身性感染，甚至可發生敗血癥，危及生命。本研究結果顯示金黃色葡萄球菌主要分離自痰液（2015年40.5%、2018年37.4%）和分泌物（2015年24.0%、2018年19.8%），說明金黃色葡萄球菌是呼吸道和外傷等感染性疾病的主要致病菌，與相關文獻報道一致[5]。金黃色葡萄球菌感染主要集中在新生兒科、外科和骨科等科室，三者約占50%。

藥物敏感試驗顯示：金黃色葡萄球菌對青霉素耐藥率最高，達96.69%/93.41%（2015年/2018年），其次為苯唑西林，耐藥率為76.86%/67.03%（2015年/2018年）；對呋喃妥因的耐藥率最低，為1.65%/1.10%（2015年/2018年），稍高的為奎奴普丁/達福普汀，耐藥率為2.48%/2.19%（2015年/2018年）。與2015年相比，2018年金黃色葡萄球菌對大多數抗菌藥物的耐藥率有不同程度的下降，說明近兩年在耐藥性控制方面取得了一定的成效。相關報道顯示MRSA的檢出率不盡相同，其原因可能與地區及樣本來源不同有關[6]。2016年中國CHINET細菌耐藥性監測結果顯示全國MRSA的檢出率達35.8%，浙江省MRSA的檢出率達37.8%，本研究MRSA的檢出率為27.27%，低于全國和全省水平，說明本地區在控制MRSA流行傳播方面做得比較好。

本研究結果顯示，金黃色葡萄球菌耐藥基因以mecA為主（76/212），檢出率為35.85%，mecA基因主要由MRSA菌株所攜帶，33株MRSA菌株均攜帶mecA基因，且100%耐青霉素G。此結果與相關報道一致[7]。金黃色葡萄球菌對四環素耐藥主要由tetM、tetK基因介導。本研究中tetM、tetK都未被檢出，四環素的耐藥率也較低，為8.26%/7.69%（2015年/2018年）。金黃色葡萄球菌對紅霉素耐藥主要由erm基因家族介導[8]。本研究erm基因家族檢出率為35.38%，紅霉素的耐藥率為71.07%/68.13%（2015年/2018年）。本地區金黃色葡萄球菌耐紅霉素應該還存在其他耐藥機制。aac（6'）-aph（2'）主要介導氨基糖苷類藥物的耐藥。本研究中aac（6'）-aph（2'）檢出率為5.66%，慶大霉素的耐藥率為12.39%/9.89%（2015年/2018年），兩者關系基本相符。文獻報道[9]稱替考拉寧與萬古霉素都是糖肽類抗菌藥物，其作用機制相似，但替考拉寧的蛋白結合率更高。本研究中212株金黃色葡萄球菌對替考拉寧的耐藥率為49.59%/47.25%（2015年/2018年），對萬古霉素的耐藥率為3.31%/5.49%（2015年/2018年），替考拉寧的耐藥率遠高于萬古霉素，可能與本地區替考拉寧的使用量有關。

綜上所述，本地區治療金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病可優先考慮呋喃妥因、奎奴普丁/達福普汀和萬古霉素。與2015年相比，2018年收集的金黃色葡萄球菌對大多數常用抗菌藥物的耐藥率有不同程度的下降，說明近年在耐藥性控制方面取得了一定的成效。