食涼茶揮發油提取工藝及抗菌活性研究

李巧云

（麗水市職業高級中學，浙江麗水323000）

白色念珠菌是一種常見條件致病性真菌[1]，可寄居在人體不同部位，如皮膚、口腔、胃腸道等，引起皮膚、黏膜病變，也可引起危及生命的系統性感染。隨著臨床上淺部和深部真菌感染發病率不斷增長，念珠菌感染發病率在逐年升高，白色念珠菌已經變成了重要的感染病原體之一。因此，尋找安全、有效的抗真菌藥物一直是研究的熱點。中草藥在抗白色念珠菌感染的預防和治療中具有一定的優勢。

食涼茶屬于畬族民間草藥，為蠟梅科（Calycanthaceae）蠟梅屬（Chimonanthus）植物，學名柳葉蠟梅（Chimonanthus salicifolius）[2]。食涼茶性涼，味微苦、辛。現代研究及臨床試驗表明：食涼茶有明顯的解熱鎮痛、抗菌、抗病毒等作用，其中在抗菌方面，食涼茶揮發油被驗證具有良好的生物活性。李萍[3]等人通過體內外抑菌實驗發現山臘梅感冒茶對金黃色葡萄球菌感染有明顯的抑制作用；刁君成[4]等人對山臘梅葉消毒抑菌作用開展了進一步的研究，發現山臘梅葉藥片溫熱蒸發物質對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用。但目前對其抗菌作用的研究主要集中在細菌感染方面，而抗真菌的報道較少。因此，本實驗以食涼茶揮發油為研究對象，開展食涼茶揮發油體外抗真菌試驗，希望能為民族醫藥抗真菌研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

二氯甲烷、無水硫酸鈉、吐溫-80、RPMI1640液體培養基、刃天青（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 實驗菌種和材料

白色念珠菌（中國普通微生物菌種保藏管理中心）、食涼茶（購自藥材市場）。

1.3 儀器

XL-06B300克密封型搖擺式粉碎機（廣州市旭朗機械設備有限公司）；TC-15恒溫電熱套（海寧市華星儀器廠）；揮發油測定器、超凈工作臺（博迅SW-CJ-1CU）等。

1.4 食涼茶揮發油提取方法

經粉碎后的食涼茶粉末，過20目標準篩。準確稱取過篩后的藥材粉末30 g置于圓底燒瓶中，加入玻璃珠數粒，按料液比加入蒸餾水，玻璃棒攪拌均勻。浸泡一段時間后，按2015版《中國藥典》（通則2204）揮發油測定法甲法提取，停止加熱，分取油層，用二氯甲烷萃取，再經無水硫酸鈉干燥[5]，常溫揮去二氯甲烷后采用減重法稱定揮發油的重量，并計算揮發油提取率。

揮發油提取率（%）=提取的揮發油的重量（g）/藥材粉末質量（g）×100%

1.5 菌液及藥物的制備

將保存的白色念珠菌劃線分離純化后，挑取單菌落于沙氏液體培養基中振蕩培養24 h，獲得白色念珠菌菌液，用血細胞計數法[6]在顯微鏡下觀察計數，用0.9%無菌生理鹽水調整使初始菌懸液濃度控制在1.5×106CFU/mL。取適量初始菌懸液用RPMI1640液體培養基稀釋1 000倍，使菌懸液的最終濃度控制在1×103～5×103CFU/mL，即得接種菌懸液。將揮發油以吐溫-80溶解[7]后，用RPMI1640液體培養基倍比稀釋，制取終質量濃度為500 mg/mL及1 mg/mL的揮發油藥液，吐溫-80終體積分數為0.005%（V/V）。

1.6 刃天青法檢測揮發油對白色念珠菌最低抑菌濃度（MIC）

用96孔板微量稀釋法[8-9]，制成含揮發油50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25、0.390 625、0.195 312 5和0.097 656 mg/mL的系列濃度藥物，向1～11孔中各加100 μL接種菌懸液。第11孔為生長對照，第12孔為空白培養基對照，處理三組重復。96孔板用封口膜密封置于濕盒中，35℃培養12 h后向每孔中加入過濾除菌后的1 g/dL刃天青試劑2 μL，觀察其顏色變化。以第11孔陽性對照由藍色（氧化狀態）變為粉紅色（還原狀態）、第12孔空白對照保持藍色作為判斷實驗操作是否合格的標準。以發生顏色變化的前一孔為最低抑菌濃度（MIC）[10]。

2 結果與分析

2.1 食涼茶揮發油提取工藝的研究

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 提取時間的選擇

設置提取時間為 0.5、1、1.5、2、2.5 h，料液比（mg/mL）為1:8，不浸泡，按1.4的方法進行提取并計算其提取率，結果如圖1所示。提取開始時，食涼茶揮發油的提取率隨時間的延長而增加，當提取時間為2 h時達到最高，隨后又慢慢降低。分析：可能由于隨著提取時間的增加，料液中的揮發油逐漸被提取完全，隨后由于繼續加熱，使揮發油揮發，導致提取率有所下降。綜上所述，因此選取1.5 h、2 h、2.5 h 進行正交實驗。

2.1.1.2 浸泡時間的選擇

設置料液比（mg/mL）為 1:8，提取 1.5 h，按 1.4的方法進行提取并計算其提取率，結果如圖2所示。食涼茶揮發油提取率隨浸泡時間的延長先增加后降低，在浸泡時間2 h處達到最高，說明浸泡時間對食涼茶揮發油的提取有影響。有研究[11-12]認為，浸泡可使植物組織細胞充分膨脹，細胞間隙變大，從而加快細胞內外物質的動態交換促進有效成分的溶出，但過度浸泡會使食涼茶組織受損，料液體系變得復雜，影響揮發油的提取，并可能導致揮發油的散失。故細化最佳浸泡時間，選擇1.5 h、2.0 h、2.5 h進行后續正交實驗。

2.1.1.3 料液比的選擇

設置料液比（mg/mL） 為 1:8、1:10、1:12、1:14、1:16，提取時間為 1.5 h，不浸泡，按 1.4的方法進行提取并計算其提取率，結果如圖3所示。在1:8～1:10間隨著料液比的增加，食涼茶揮發油提取率上升趨勢顯著。而在1:10～1:14范圍內，食涼茶揮發油提取率隨料液比的增大穩定下降。雖然在1:16處有回升趨勢，但料液比過大，容易導致料液暴沸，同時能耗也隨之增加。因此從節約能源和提取效率角度考慮，實驗選取1:9、1:10、1:11三個料液比梯度進行正交實驗。

圖1 提取時間對食涼茶揮發油提取率的影響

圖2 浸泡時間對食涼茶揮發油提取率的影響

圖3 料液比對食涼茶揮發油提取率的影響

2.1.2 正交試驗

采用水蒸氣蒸餾法，以食涼茶揮發油提取率為考察指標，以提取時間（A）、浸泡時間（B）、料液比（C）為影響因素[13]進行L9（33）正交試驗設計[14]考察不同因素對揮發油提取率的影響。由表1極差分析可知，3個因素對食涼茶揮發油提取率的影響大小為B>C>A，即浸泡時間>料液比>提取時間。揮發油提取工藝的最佳組合為A2B3C2，即提取時間2.0 h，浸泡時間2.5 h，料液比1:10。

表1 食涼茶揮發油正交試驗結果分析表

2.1.3 驗證實驗

按照正交試驗優選出的最佳組合方案做3組平行試驗，取其平均值，食涼茶揮發油提取率為1.95%。

2.2 食涼茶揮發油體外抗白色念珠菌效果

刃天青法檢測揮發油對白色念珠菌的最小抑菌濃度（MIC），是以刃天青作為指示劑，通過觀察孔內顏色，判斷食涼茶揮發油的抑菌活性。活菌新陳代謝的產生，使刃天青指示劑由藍色變為粉紅色，而死菌則不能。表2是加入刃天青后各孔顏色顯示情況，通過對比可以發現，食涼茶揮發油對白色念珠菌的最小抑菌濃度（MIC）為6.25 mg/mL。將1～4孔的菌藥混合物涂布培養后顯示，第4孔有白色念珠菌單菌落長出，而從1～3孔中取出的混合液沒有長出白色念珠菌，故最低殺菌濃度（MBC）為12.5 mg/mL。

3 討論

食涼茶作為畬族常用藥材，歷史悠久，療效多樣，在藥用、保健等方面具有較好的開發利用價值。揮發油是食涼茶的主要成分之一，近年來，對該類物質的研究也有很多，目前已知食涼茶在抗菌等方面具有良好的生物活性，但相關研究主要集中于抗細菌感染，未見抗真菌感染的研究報道，因此，筆者在此基礎上對其抗真菌作用展開相關研究，以完善食涼茶的抗菌作用。

揮發油作為食涼茶的主要成分之一，含有許多具有藥理活性的有效物質，食涼茶揮發油質量的穩定，是其藥理活性的保證，因此對其揮發油提取工藝的研究具有重要價值。本實驗結果表明，提取時間、料液比、浸泡時間對食涼茶揮發油的提取率均有影響，其中浸泡時間對揮發油提取率的影響最大，料液比其次，最后是提取時間，這可能與食涼茶日常飲用方式有關，浸泡時間及料液比對其揮發性物質的溶出有較為密切的影響。

本實驗采用刃天青法測得食涼茶揮發油對白色念珠菌的最小抑菌濃度（MIC）為6.25 mg/mL，最小殺菌濃度為12.5 mg/mL。通過觀察各孔顏色發現，在加入刃天青后，最低抑菌濃度（即未變紅的孔）會隨培養時間的延長向高濃度推移，這與李宙陽[15]等人研究結果一致，但達到上述濃度后孔內顏色能維持較長時間不再變化，說明該實驗結果有效。

4 結語

綜上所述，食涼茶揮發油的優化提取條件為：提取時間2.0 h，浸泡時間2.5 h，料液比1:10，在此條件下食涼茶揮發油的提取率為1.95%。通過實驗證明食涼茶揮發油對白色念珠菌體內體外均有抑制效果，食涼茶揮發油對白色念珠菌的最小抑菌濃度（MIC）為 6.25 mg/mL，最小殺菌濃度（MBC）為12.5 mg/mL。本研究為食涼茶揮發油藥物的應用提供理論基礎，并為更多真菌感染的治療提供參考。

表2 刃天青法測MIC中顏色與藥物濃度的對應關系