地榆膏對大鼠深Ⅱ度燙傷的治療作用*

桑龍燕，李 莉，程孝平，谷 梅，李 響，葉伊琳△

（1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院傷口造口門診，安徽 合肥 230031）

燒燙傷主要發生在皮膚或黏膜，嚴重的燒傷會導致皮下或黏膜下的組織，如肌肉、骨、關節甚至內臟等受累，愈合過程中也易形成感染與瘢痕，給患者造成極大的痛苦和諸多不便。目前治療燒燙傷的化學藥物較多，主要為抗生素、銀鹽等，作用機制較為單一，并且近些年抗生素濫用、細菌耐藥等現象不斷增多[1]，因此研究開發不良反應小，多靶點的中藥已成為燒燙傷治療藥物的研究熱點[2-3]。地榆膏為安徽中醫藥大學第一附屬醫院特色院內制劑，具有清熱解毒、活血生肌、祛瘀通絡的作用，經數十年的臨床應用，顯示出良好的促創面愈合的功效[4]，為進一步了解其作用機制，本實驗采用高溫燙傷法建立大鼠深II度燙傷模型[5]，以美寶濕潤燒傷膏和莫匹羅星作為陽性對照組，觀察地榆膏對大鼠燙傷創面愈合的療效及作用機制，為地榆膏在臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性SD大鼠90只，體質量200～230 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，生產許可證SCXK（皖）2017-001。大鼠在室溫（25±5）℃和濕度（50±15）%條件下喂養。

1.2 藥物與試劑 地榆膏：藥物來源于安徽中醫藥大學第一附屬醫院中醫特色護理門診，由地榆、沒藥、當歸、白芷、大黃、紅花等多種中藥粉碎成細粉，以凡士林等為基質混勻加熱制成；美寶濕潤燒傷膏（汕頭市美寶制藥有限公司，批號：1901303B）；莫匹羅星（中美天津史克制藥有限公司，批號：19070206）；CD31抗體（賽維爾生物科技有限公司，批號：LS193523）；IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒（睿信生物科技有限公司，批號：07/2019）。

1.3 實驗儀器 YD-6L生物組織冷凍包埋機（金華市益迪醫療設備有限公司）；HM 325石蠟切片機（Thermo scientific公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Flour Chem M型凝膠成像分析儀（美國 Protein Simple公司）；MK3型酶標儀（美國Thermo公司）；H3-18KR臺式高速冷凍離心機（湖南可成儀器設備有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組 大鼠適應性喂養1周。隨機分為5組，分別為正常組、模型組、美寶濕潤燒傷膏組、莫匹羅星組、地榆膏組，每組18只。各組分籠飼養，保持自由飲水和標準飲食，定時清潔消毒。

1.4.2 造模 除正常組外，其余各組大鼠用水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后將大鼠俯臥固定于木板上，用推毛機推去背毛4 cm×4 cm大小，再用薇婷脫毛膏將該區域脫凈，消毒。取鐵棒放于沸水中煮30 min后迅速置大鼠脫毛區15 s，造成面積為10 cm2的深II度燙傷創面[5]，正常組僅麻醉、脫毛。

1.4.3 給藥及取材 造模后立即給藥，各用藥組在每次給藥前，用生理鹽水清洗創面以除去殘留受試物，再將對應藥膏分別涂抹于創面，厚度約1.5 mm，用藥后各組創面保持開放。每日給藥2次，間隔12 h，連續21 d。正常組和模型組僅用生理鹽水外擦脫毛區，每日2次，正常組定期脫毛，連續21 d。各組分別在燙傷后7、14、21 d隨機選取6只大鼠，拍攝創面，并麻醉，腹主動脈取血，3 500 r/min離心15 min，血清放入-80℃冰箱冷藏備用，用于ELISA檢測；取創面中心至創緣正常皮膚間的新生肉芽組織，置4%的多聚甲醛中固定，用石蠟包埋標本，切片厚度5 μm，備用。

1.4.4 檢測指標 ①創面大體觀察：各組大鼠給藥后每日觀察燙傷部位的腫脹、顏色、創面結痂以及脫痂等情況。②創面愈合率：將在燙傷后7、14、21 d所拍攝各組大鼠創面照片，結合Image J軟件計算創面面積，計算創面愈合率，創面愈合率=（原始創面面積-未愈合創面面積）/原始創面面積×100%。③ELISA法檢測血清中IL-6和TNF-α的含量：取燙傷后第7、14、21 d各組大鼠血清，ELISA試劑盒檢測血清中IL-6和TNF-α的含量，按試劑盒說明書操作。④病理組織學觀察：取燙傷后7、14、21 d各組大鼠皮膚切片，采用HE染色后，將切片置于顯微鏡×100的視野下觀察。⑤免疫組化法檢測創面組織CD31的表達：取燙傷后7、14、21 d各組大鼠皮膚切片，浸入EDTA修復液中，微波抗原修復，滴加 CD31（1：600）一抗，4℃冰箱過夜，按二抗試劑盒說明添加二抗，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，采用光鏡（×400）觀察細胞內CD31的表達情況（細胞內含有棕黃色顆粒即為CD31陽性表達的細胞）。每張切片隨機取3個視野，分別計數視野中CD31陽性表達的細胞數。

1.5 統計學分析 采用SPSS 21.0進行統計分析。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，兩組均數比較，采用2個獨立樣本t檢驗；除正常組外的其余4組均數比較，采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 地榆膏對深Ⅱ度燙傷大鼠創面的整體觀察 各組大鼠燙傷后當日皮膚灰白色，皮膚彈性降低；燙傷后1～2 d各組大鼠創面出現不同程度腫脹，后逐漸形成界限清楚的痂皮，其中燙傷后5 d，地榆膏組大鼠最早出現痂皮。燙傷后7 d，地榆膏組大部分大鼠創面無腫脹，已形成痂皮；美寶濕潤燒傷膏組少數大鼠形成痂皮；莫匹羅星組大鼠創面呈輕度腫脹，未形成痂皮；模型組大鼠創面腫脹明顯、創緣黑紫，均未結痂。燙傷后14 d，地榆膏組痂皮全部脫落，創面邊緣皮膚愈合顯著；美寶濕潤燒傷膏組部分痂皮開始脫落；莫匹羅星組和模型組大鼠創面邊緣均見痂皮。燙傷后21 d，地榆膏組大鼠創面明顯愈合，且無明顯瘢痕形成；美寶濕潤燒傷膏組全部脫落，創面面積均明顯縮小；莫匹羅星組和模型組大鼠創面痂皮部分脫落；正常組無陽性癥狀，見圖1。

圖1 傷后不同時相點各組創面變化

2.2 地榆膏對深Ⅱ度燙傷大鼠的創面愈合率影響燙傷后7 d，地榆膏組、美寶濕潤燒傷膏組大鼠創面愈合率明顯高于模型組（P＜0.05）；燙傷后 14、21 d，3組給藥組大鼠創面愈合率明顯高于模型組（P＜0.05），且地榆膏組創面愈合率明顯高于莫匹羅星組（P＜0.05），見表 1。

表1 燙傷后不同時相點各組創面愈合率（±s，n=6，%）

表1 燙傷后不同時相點各組創面愈合率（±s，n=6，%）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與莫匹羅星組比較，△P＜0.05。

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2.3 地榆膏對深Ⅱ度燙傷大鼠血清中IL-6和TNF-α水平的影響 燙傷后7、14、21 d，模型組血清中炎性因子IL-6和TNF-α水平明顯高于正常組（P＜0.05）；隨時間進程，炎性因子水平逐漸降低；地榆膏組和美寶濕潤燒傷膏組、莫匹羅星組IL-6和TNF-α水平明顯低于模型組（P＜0.05），且變化趨勢與模型組相同，見表2、表3。

表2 燙傷后不同時相點各組IL-6含量（±s，n=6，pg/mL）

表2 燙傷后不同時相點各組IL-6含量（±s，n=6，pg/mL）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 7 d 14 d 21 d正常組 127.73±29.13 125.92±17.72 116.41±9.19模型組 335.16.15±31.67#222.48±26.06#174.61±15.24#美寶濕潤燒傷膏組 291.05±27.42* 151.85±16.85*130.91±16.68*莫匹羅星組 282.01±26.40* 160.80±21.05*138.56±15.86*地榆膏組 253.24±26.59* 140.13±15.24*128.44±23.56*

表3 燙傷后不同時相點各組TNF-α含量（±s，n=6，pg/mL）

表3 燙傷后不同時相點各組TNF-α含量（±s，n=6，pg/mL）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 7 d 14 d 21 d正常組 74.32±6.03 67.81±5.08 65.71±6.04模型組 205.71±15.63#141.70±15.55#100.74±9.09#美寶濕潤燒傷膏組 168.26±13.64*101.03±12.44*79.07±10.03*莫匹羅星組 145.93±14.19* 92.00±12.03* 85.22±13.86*地榆膏組 156.61±15.43* 85.98±7.18* 70.09±7.80*

2.4 地榆膏對深Ⅱ度燙傷大鼠創面病理組織學的影響 正常組各層結構完整，表皮層扁平整齊，毛囊和皮脂腺分布均勻，真皮層組織和附屬結構清晰。燙傷后7 d，地榆膏組、美寶濕潤燒傷膏組、莫匹羅星組和模型組各組大鼠創面組織中可見成纖維細胞、新生毛細血管等增加，且尤以地榆膏組大鼠增加最為明顯。燙傷后14 d，地榆膏組大鼠創面組織中炎癥細胞浸潤明顯減少，表皮增厚，膠原纖維排列趨于整齊，美寶濕潤燒傷膏組次之，美寶濕潤燒傷膏組和模型組較差。燙傷后21 d，地榆膏組大鼠創面組織中的表皮細胞已基本覆蓋創面，膠原纖維排列整齊；美寶濕潤燒傷膏組表皮局灶性上皮島增生；莫匹羅星組和模型組膠原纖維排列仍較紊亂，見圖2。

圖2 燙傷后不同時相點組織病理學變化（×100）

2.5 地榆膏對深Ⅱ度燙傷大鼠創面組織CD31表達的影響 正常組和各燙傷組大鼠在燙傷后各時間點CD31均有表達，且在14 d時達到峰值。燙傷后7、14、21 d，模型組創面CD31相對表達量明顯高于正常組（P＜0.05）；燙傷后 7 d，地榆膏組、美寶濕潤燒傷膏組創面CD31相對表達量明顯高于模型組（P＜0.05）；燙傷后 14、21 d，地榆膏組、美寶濕潤燒傷膏組、莫匹羅星組創面CD31相對表達量均明顯高于模型組（P＜0.05），且地榆膏組創面CD31相對表達量明顯高于莫匹羅星組（P＜0.05），見圖 3、圖 4。

圖3 燙傷后不同時相點各組CD31蛋白表達（×400）

圖4 燙傷后不同時相點各組CD31相對表達量

3 討論

地榆膏為安徽中醫藥大學第一附屬醫院特色制劑，主要由地榆、沒藥、當歸、白芷、大黃、紅花、冰片等多種中藥制成。具有清熱解毒、活血生肌、祛瘀通絡之功效，是醫院長期用于治療各種燒燙傷等疾病的經驗方，可縮短創面愈合時間，臨床療效顯著[4]。本次實驗采用高溫燙傷法制備大鼠深Ⅱ度燙傷模型，結果發現地榆膏可明顯減輕創面炎癥、腫脹和壞死等病理改變，促進痂殼脫落、成纖維細胞與毛細血管生成以及上皮島增生，提高燙傷后不同時間點的創面愈合率，表明地榆膏治療大鼠深Ⅱ度燙傷具有良好療效。

深Ⅱ度燙傷創面修復是一個涉及多個生物學的比較復雜的過程，主要包括炎癥反應期、肉芽組織形成期、組織重塑期[6-8]。在中醫理論體系中，地榆膏促進創面愈合旨在解毒、活血、通絡、生肌。創面修復過程中釋放的炎性因子是影響創面修復的重要因素之一[9-10]，深Ⅱ度燙傷創面在愈合過程中，正氣不足，抗邪無力，邪毒乘虛而入，易引起感染和炎癥，適當的炎癥反應可以促進創面愈合，過度炎癥反應則會延緩創面愈合。炎性因子IL-6和TNF-α是一類具有多重免疫調節功能的細胞因子，是刺激創面愈合過程所必需的物質之一，參與了創面愈合的各個階段，低水平的IL-6和TNF-α可以直接或間接的刺激巨噬細胞，促進成纖維細胞、生長因子以及膠原合成，從而增強創面愈合[11-12]，但濃度過高時會導致成纖維細胞凋亡，減少生長因子和膠原的表達從而導致創面延遲愈合。因此，控制炎性因子的水平對創面愈合具有重要作用[13-16]。本實驗中，與模型組相比，地榆膏組可明顯抑制炎性因子IL-6和TNF-α的釋放，與美寶濕潤燒傷膏組和莫匹羅星組相比無明顯差異，也暗示地榆膏解毒之功效可通過抑制過度的炎癥反應[17-18]來解釋。

微血管是血液和組織細胞進行物質交換的場所，微血管的結構功能正常與否直接關系到創面組織的血氧供給、細胞新生，從而對促進創面愈合起到重要作用[19]。《靈樞·經脈》云：“經脈十二者，伏行于分肉之間。深而不見……諸脈之浮而常見者，皆絡脈也。”《臨證指南醫案》云：“經主氣，絡主血”“初為氣結在經，久則血傷入絡。”說明絡脈是氣血會聚之處[20]，在中醫理論中，微血管相當于中醫的絡脈，治療上應補益氣血，通暢絡脈。血小板-內皮細胞黏附分子1（PECAM-1）又稱 CD31，主要存在于血管內皮組織，參與維持血管壁屏障的完整性，且是血管內皮分化的標志，CD31在創面修復過程中能客觀、直接地反映創面血管生成及愈合程度[21-24]。本實驗中，地榆膏組在燙傷后7、14、21 d創面組織中CD31相對表達量均明顯高于模型組，顯示其良好的促血管生成作用，與其功效中的“活血、通絡、生肌”不謀而合。

同時在實驗中發現燙傷后14、21 d，地榆膏組不僅在創面愈合率方面優于莫匹羅星組，且在促血管生成方面也優于該組，但在抑制炎癥因子方面與該組無明顯差異，提示了地榆膏多途徑和多靶點的作用帶來的療效要優于作用單一的莫匹羅星，進一步顯示了中藥復方地榆膏治療疾病的優勢。地榆膏方藥組成中地榆、大黃等具有清熱解毒功效，可抑制炎癥反應，改善血液循環[25]；紅花、當歸、沒藥等諸藥共奏活血、通絡生肌功效，從而使地榆膏在創面修復中發揮中藥復方獨特的治療優勢[26-29]。