異補骨脂素聯合鋅治療對1型糖尿病大鼠骨量、骨密度及骨強度的影響

常培學 李海波 方其超 許振培 符茂雄

1. 海口市第四人民醫院老年病科、內分泌科，海南 海口 571100 2. 海口市第四人民醫院腎內科血透室，海南 海口 571100 3. 海南醫學院附屬第二人民醫院內分泌科，海南 海口 570311

近年來，由于不合理的生活方式，飲食習慣和社會老齡化，糖尿病及其相關并發癥的發病率迅速增加。據預測，到2045年全球糖尿病患病人數將增加到6.29億[1]。糖尿病已成為另一個全球公共衛生問題。骨量流失是糖尿病的并發癥之一，它是繼發性骨質疏松癥之一，其特征是鈣磷代謝紊亂，BMD下降和骨微觀結構變化[2]。鋅作為一種必需的微量元素，在人體中起著重要的生理作用。鋅也是胰島素的一種成分，它調節胰島細胞分泌胰島素并穩定血糖，因此據報道鋅對糖尿病大鼠有降血糖作用[3]。許多研究發現鋅對去卵巢大鼠有骨保護作用[4]。值得注意的是，異補骨脂素是從多種水果，蔬菜和傳統中藥中分離得到的，對卵巢切除術引起的骨質疏松具有保護作用[5]。此外，異補骨脂素通過增加小梁骨微觀結構的強度以及對骨形成的刺激作用[6]，促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞的分化[7]。然而，鋅聯合異補骨脂素是否有益于保護糖尿病患者骨量還沒有報道。因此，在本研究中，我們通過注射鏈脲佐菌素建立1型糖尿病大鼠模型，并通過補鋅和異補骨脂素來觀察其對糖尿病大鼠骨量的保護作用及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 研究方案

50只12周齡體重為230～260雌性SD大鼠用于本研究中；所有大鼠適應性喂養7 d后，其中40只大鼠均腹腔一次性注射鏈脲佐菌素(STZ)(劑量60 mg/kg)構建1型糖尿病模型。STZ在pH為4.5的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中溶解；劑量是基于先前報道的劑量[8]。對照組10只大鼠注射檸檬酸緩沖液。72 h后，用ACCU-CHEK Advantage血糖儀(Indianapolis Roche Medical Company，IN，USA)測量血糖以確認模型建立成功。隨后將糖尿病大鼠分為以下4組，每組10只，分別為單純對照組(Con)、鋅治療組(Zn)、異補骨脂素組(Bgz)以及鋅聯合異補骨脂素組(Zn+Bgz)；鋅治療組、異補骨脂素組以及鋅聯合異補骨脂素組大鼠分別給予0.25 mg/(kg.d)硫酸鋅灌胃；20 mg/(kg.d)異補骨脂素灌胃給藥或者兩者聯合給藥治療，連續12周。

1.2 標本獲得及檢測

為了評估藥物治療對大鼠骨量和骨密度的影響，使用Micro-CT在給藥周期結束時對每只大鼠的右側股骨進行掃描。使用Micro-CT掃描儀(SkyScan-1076 in IVIVE CT-scanner；SkyScan，Kontich，比利時)對股骨遠端進行具有18 μm的各向同性掃描(每次掃描設置參數70 kV、85μA、180°)。使用Micro-CT自帶的軟件(V1.11.0.0；SkyScan)計算骨體積分數(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁數目(Tb.N)和骨密度(BMD)。

隨后進行組織學檢測，用10%緩沖福爾馬林固定大鼠右股骨24 h，然后用10%乙二胺四乙酸脫鈣14 d。然后用乙醇和二甲苯對骨頭進行脫水處理。石蠟包埋切片后，用蘇木精和伊紅(HE)染色制成4 μm薄的組織學切片。這些圖像隨后用光學顯微鏡獲得。

隨后進行三點彎曲試驗以評估骨骼強度變化，使用商用力學測試系統(Bose Electrforce 3220，Bose Corp，Eden Prairie，MN)，通過三點彎曲試驗檢查左側股骨，以評估整個骨骼的力學性能。股骨樣本置于兩個固定加載點之間跨度為20 mm的下部支架上。上加載板在骨干中點施加2 N的預緊力固定試件，然后以2 mm/min的恒定位移速率施加載荷直至破壞。同時繪制了荷載-位移曲線，并對數據進行了自動分析。根據三點彎曲載荷-位移曲線計算最大載荷、最大剛度和最大破壞能量。

后對股骨組織進行蛋白印跡檢測，將右側股骨組織中段在含有液氮的砂漿中用研磨器研磨成粉末狀。用骨組織專用蛋白提取試劑盒(BestBio，中國上海)分離脛骨標本中的蛋白質。用10 %的三甘氨酸SDS-PAGE電泳40 g/樣品，然后轉移到PVDF膜(EMD微孔，Billerica，MA)。在含5%牛血清白蛋白的TBST(三緩沖液，0.5%吐溫-20)中封閉1 h后，在含5%牛血清白蛋白的TBST中與抗 p-GSK-3β(ABCAM)、GSK-3β(ABCAM)、β-catenin (ABCAM)和β-actin的一抗孵育過夜，然后以1∶3 000稀釋。使用ECL化學發光系統(GE ImageQuant 350，GE Healthcare)可視化蛋白條帶，然后使用QuantityOne軟件(Bio-Rad)進行分析。

1.3 統計學處理

使用SPS 19.0軟件進行統計分析。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s test比較不同組間的數據。P<0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠組織學變化

HE結清楚表明，Zn聯合Bgz治療能更好的保護1型糖尿病大鼠骨量的流失。如圖1所示，與Con組相比，Zn、Bgz及Zn+Bgz組的大鼠骨小梁數量和密度得到明顯的改善，而在Zn+Bgz組表現的最為明顯。

圖1 三組大鼠股骨干骺端HE切片檢測結果注：A Con組，B Zn組，C Bgz組，D Zn+Bgz組 (20×)。Fig.1 Results of HE slices in the femoral metaphysis of three groups of rats

2.2 Micro-CT檢測結果

Micro-CT更好的顯示了骨小梁的總體改變情況，股骨的微觀參數如圖2所示。Zn組、Bgz組、Zn+Bgz組左側股骨干骺端骨小梁BMD、Conn.D、Tb.N、Tb.Th較Con組明顯升高，而Tb.Sp較Con組明顯降低 (P<0.05)；而Zn+Bgz組BMD、Conn.D、Tb.N、Tb.Th較Zn組、Bgz組明顯升高，而Tb.Sp較Zn組、Bgz組明顯降低(P均<0.05)。

圖2 四組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結果注：a Con組，b Zn組，c Bgz組，d Zn+Bgz組；與Con組相比，*P<0.05；與Zn組相比，#P<0.05；與Bgz組相比，&P<0.05。Fig.2 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of four groups of rats

2.3 骨強度改變比較

四組骨生物力學結果如圖3所示，和Con組比較，Zn組、Bgz組和Zn+Bgz組左側股骨最大負荷、剛度和最大功耗較Con組明顯升高(P<0.05)；而Zn+Bgz組最大負荷、剛度和最大功耗較Zn組和Bgz組明顯升高 (P均<0.05)。

圖3 各組大鼠股骨最大負荷(A)、剛度(B)和最大功耗 (C)注：與Con組相比，*P<0.05；與Zn組相比，#P<0.05；與Bgz組相比，&P<0.05。Fig.3 Changes in the maximum femoral load(A), stiffness(B), and energy to failure (C)of rats in each group

2.4 Wnt/β-catenin信號通路改變

和Con組比較，Zn組、Bgz組和Zn+Bgz組的大鼠Wnt/β-catenin信號通路被激活；Wnt 1、Wnt 5a、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。和Zn組和Bgz組比較，Zn+Bgz組Wnt 1、Wnt 5a、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 使用WB檢測Wnt 1、Wnt 5a、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin和β-actin的相對表達注：與Con組相比，*P<0.05；與Zn組相比，#P<0.05；與Bgz組相比，&P<0.05。Fig.4 Relative expression of Wnt 1、Wnt 5a，p-GSK-3β, GSK-3β, β-catenin to β-actin using Western blotting

3 討論

糖尿病骨質疏松癥(DOP)是糖尿病并發癥之一。胰島素的缺乏會導致鈣和磷代謝紊亂，從而導致骨密度降低和骨微結構改變[9]。在高血糖環境中，糖尿病會影響骨骼代謝和骨骼完整性[10]，抑制成骨細胞分化，誘導成骨細胞凋亡，削弱骨形成并抑制骨礦化[11]，因此認為高血糖是誘發糖尿病性骨質減少的重要因素[12]。據報道鋅對雌激素缺乏引起的骨質流失具有有益作用，據推測鋅對絕經后骨質疏松癥具有保護作用[13]。先前的體內和體外研究表明異補骨脂素具有骨保護作用。例如，向缺乏性激素的小鼠施用異補骨脂素(10和20 mg/kg，持續8周)后，骨質疏松癥狀得到改善，小鼠表現出增強的骨強度和改善的小梁骨微結構[14]。然而，尚未研究鋅聯合異補骨脂素是否較單獨使用對糖尿病大鼠骨骼有益作用更為顯著。在本研究中，結果表明鋅聯合異補骨脂素治療12周可以預防糖尿病大鼠的骨質流失，且效果較單獨使用更為顯著。

在本研究中，在糖尿病大鼠中觀察到BMD降低，以及骨骼結構破壞，在鋅或者異補骨脂素干預12周后，這些癥狀明顯改善，骨密度明顯升高，證實鋅或者異補骨脂素對糖尿病大鼠骨密度降低具有保護作用，而鋅聯合異補骨脂素治療組骨密度改變最為顯著。除了骨密度，骨保護的另一個重要評估指標是骨骼的形態參數，例如骨量和骨小梁厚度等[15]。本研究發現1型糖尿病大鼠股骨干骺端的小梁骨破裂，骨小梁變薄，骨小梁之間的間距變大。鋅治療組、異補骨脂素組以及聯合治療組大鼠BV/TV、Tb.Th和Tb.N均顯著降低，而Tb.Sp顯著降低；鋅或者異補骨脂素干預治療后增加了骨小梁的數量以及之間連接明顯優于T1DM組，且聯合治療組的微觀參數最佳。本研究進一步觀察干預方法對骨強改變，結果顯示Zn+Bgz組最大負荷、剛度和最大功耗明顯優于其他組，這表明鋅聯合異補骨脂素可以顯著保護T1DM大鼠的骨量和骨強度。

本研究進一步觀察治療對典型的Wnt配體(Wnt1)的表達影響，由于該配體激活Wnt/β-catenin途徑來調節成骨細胞和骨細胞的活性[16-17]。 此外，已知非經典的Wnt配體(Wnt5a)可以激活非β-caten依賴性途徑，并參與調節骨細胞活性[18]。我們的發現表明，單一的Zn或Bgz明顯上調了大鼠Wnt1的骨骼基因表達。但是，發現Zn、Bgz或Zn+Bgz刺激對Wnt5a表達產生影響，揭示了非經典Wnt信號傳導的潛在激活。此外，我們還揭示了在Zn+Bgz刺激下大鼠中β-catenin和p-GSK-3β/GSK-3β的蛋白表達水平更高，這為經典Wnt信號的激活提供了進一步的證據。總的來說本研究結果表明，Zn+Bgz刺激骨合成代謝可能與經典和非經典Wnt信號激活均有關。

綜上，鋅及異補骨脂素對1型糖尿病引起的骨量流失均有改善作用，而兩者聯合使用時效果更佳。其保護機制與GSK-3β/β-catenin信號通路上調有關。由于研究樣本數和模型及研究時間的限制，后期會進一步研究本組合治療的優勢。