基于網絡藥理學的濟生腎氣丸治療骨質疏松癥的分子機制研究

傅繁譽 黃澤青 孫繼高 王榮田 葉恒力 陳衛衡*

1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550002 2.中國中醫科學院望京醫院，北京 100102 3.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100029

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨微觀結構的退化為主要特征，容易發生脆性骨折的一種全身性骨骼疾病[1]。隨著人口老齡化的加劇，其患病率正在逐年上升，已成為許多國家的主要公共衛生問題[2]。盡管目前我國因骨質疏松癥導致的骨折發病率、致殘率及死亡率都較高，然而患者的有效治療率卻偏低[3]。目前臨床上對于OP的治療主要采取藥物治療，包括以化學藥為主的骨吸收抑制劑、骨形成促進劑和骨礦化藥物三類[4]。

濟生腎氣丸源自宋·嚴用和《濟生方》[5]。以“腎主骨”為指導，全方具有補腎壯骨、健脾益氣之功效。有研究[6]表明濟生腎氣丸能明顯提高骨質疏松癥模型大鼠血清雌二醇、骨鈣素及降鈣素水平。但濟生腎氣丸治療骨質疏松癥的作用機制尚未完全明確，故本研究采用網絡藥理學方法，對濟生腎氣丸多成分、多靶點、多通路與骨質疏松癥的復雜網絡關系進行分析，旨在揭示濟生腎氣丸治療骨質疏松癥的作用機制，為進一步實驗驗證濟生腎氣丸作用機制提供新靶點。

1 材料和方法

1.1 濟生腎氣丸活性成分的收集與篩選

本研究通過中藥系統藥理學分析平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.php)以“熟地黃”、“山茱萸”、“牡丹皮”、“山藥”、“茯苓”、“澤瀉”、“肉桂”、“附子”、“牛膝”、“車前子”十味中藥成分作為Herb name檢索，利用口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)為篩選指標，選擇OB≥30%，DL≥0.18為符合條件的活性成分，通過TCMSP數據庫獲取濟生腎氣丸活性成分所對應的靶點，輸入到Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)中獲得藥物靶點的標準基因名稱。

1.2 方法

1.2.1骨質疏松癥靶標基因的獲取：通過CTD(https://www.thefreedictionary.com)、GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://www.omim.org)三個數據庫以“osteoporosis”為關鍵詞搜索骨質疏松癥相關靶標基因。

1.2.2交集靶點的獲取：利用Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具繪制濟生腎氣丸相關活性成分靶點和骨質疏松癥靶點的韋恩圖，獲得其交集靶點，探究濟生腎氣丸的有效成分對骨質疏松癥靶點的靶向作用。

1.2.3活性成分-交集靶點網絡的構建及拓撲分析：通過Cytoscape 3.6軟件構建活性成分-交集靶點相互作用網絡，中藥成分或靶點表示為網絡之中的節點，他們之間的聯系表示為邊，使用Cytoscape 3.6軟件中Net-work Analyzer計算連接度(Degree)參數來評價藥效成分和靶點的重要性。

1.2.4構建蛋白相互作用(PPI)網絡：將獲得的交集靶基因輸入String數據庫(http：//string-db.org)，設置物種為“Homo sapiens”，選取置信度高于0.7的數據，獲得交集基因對應的蛋白互作信息，然后導入Cytoscape軟件中利用CytoHubba插件對其進行蛋白互作分析。

1.2.5DAVID富集分析：將獲得的交集基因輸入到DAVID數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/)進行基因本體(GO)生物過程富集分析和KEGG通路富集分析(p.adjust<0.05)，將富集度高的前10名GO和前20名KEGG通過R-studio軟件用氣泡圖的形式展現出來。

1.2.6構建核心靶點-通路網絡圖：將獲得的交集基因與前20名KEGG導入cytoscape 3.6軟件構建核心靶點與通路的相互作用網絡圖，圖形的大小代表連接節點的數目，選擇明顯調控通路的基因進行基因-通路網絡分析，篩選出濟生腎氣丸治療骨質疏松癥的關鍵靶點。

2 結果

2.1 濟生腎氣丸活性成分

在TCMSP數據庫中檢索濟生腎氣丸各藥物活性成分，滿足OB≥30%和DL≥0.18，最后獲得63個活性成分。部分結果見表1。

表1 濟生腎氣丸部分活性成分Table 1 Some active ingredients in Jisheng Shenqi Pill

2.2 濟生腎氣丸活性成分的靶點預測及骨質疏松癥的靶點挖掘

通過TCMSP數據庫得到濟生腎氣丸活性成分靶點211個，經過三個數據庫(CTD)、(GeneCards)、(OMIM)共檢索出OP相關靶點3 126個，通過Venny 2.1將成分靶點與疾病靶點取交集，得到132個共同靶點，這132個共同靶點視為濟生腎氣丸治療骨質疏松癥可能的潛在靶點。見圖1。

圖1 成分靶點與疾病靶點取交集后的韋恩圖Fig.1 Venn diagram after the intersection of the component target and the disease target

2.3 濟生腎氣丸活性成分-交集靶點相互作用網絡

將濟生腎氣丸的活性成分與交集靶點關系導入Cytoscape 3.6軟件，繪制濟生腎氣丸活性成分-交集靶點的網絡關系，得到了一個包含192個點和386條邊的網絡。圖中藍色長方形為132個交集基因，圓圈代表各個藥物，藍色代表車前子，淺紫色代表茯苓，灰色代表附子，深紫色代表牡丹皮，淺綠色代表牛膝、深綠色代表山藥、粉色代表山茱萸，黃色代表澤瀉，紅色代表多種藥物，見圖2。由此可見濟生腎氣丸是以多成分-多靶點-多途徑的形式來治療骨質疏松癥的，體現了濟生腎氣丸治療OP作用機制的系統性與復雜性。根據連接度值(degree)大小排列，其中槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、漢黃芩素(Wogonin)的連接度值位于前三名，分別為98、37、28，是與交集靶點連接較緊密的活性成分，表明這3個成分可能是濟生腎氣丸治療OP的重要核心活性成分，具有重要意義。

圖2 濟生腎氣丸有效成分-交集靶點網絡分析Fig.2 Analysis of the active ingredient-intersection target network of Jisheng Shenqi pill

2.4 蛋白相互作用(PPI)網絡分析

將濟生腎氣丸與骨質疏松癥交集靶點導入String數據庫中，獲得交集蛋白相互作用關系，去掉無連接的蛋白，再將獲得的蛋白互作用關系導入Cytoscape軟件中利用CytoHubba插件根據degree值進行網絡圖的構建，該網絡由122個節點與915條邊構成，見圖3。圖中圓形節點表示單個基因蛋白，節點之間的連線代表2個蛋白有相互作用關系，線越多代表作用關系越強，圖形的大小、顏色由淺變紅映射degree值由小變大，根據結果得到：AKT1、MAPK1、MAPK8、IL6、JUN、VEGFA等基因排名靠前，可能為濟生腎氣丸治療OP的核心靶點。

圖3 蛋白相互作用關系圖Fig.3 Protein interaction diagram

2.5 DAVID富集分析

采用DAVID在線數據庫進行GO和KEGG通路分析，濟生腎氣丸可影響基因本體(gene ontology，GO)生物學過程2 127個，其中生物過程(biological process，BP)1 945個，細胞組成(cellular component，CC)55個，分子功能(molecular function，MF)127個；京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)代謝通路147條。如圖4所示，在生物學過程(BP)中富集顯著度較高的是對有毒物質的反應，對細胞外刺激的反應，對氧化應激的反應，對營養水平的反應等；在細胞組成(CC)中富集顯著度較高的是膜微區、膜區域、核染色體部分、核染色質等；在分子功能(MF)中富集顯著度較高的是DNA結合轉錄激活因子活性、RNA聚合酶II近端啟動子序列特異性DNA結合、血紅素結合、核受體活性等。通過KEGG分析得到148條富集通路，圖5為富集程度最高的前20條代謝通路。主要涉及腫瘤壞死因子信號通路、白細胞介素17信號通路、AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路等，表明濟生腎氣丸可能通過作用于這些通路起到治療OP的作用。

圖4 GO富集分析氣泡圖Fig.4 Bubble chart of GO enrichment analysis

圖5 通過KEGG分析得到濟生腎氣丸治療OP作用預測靶點通路Fig.5 Prediction of target pathways for the effect of Jisheng Shenqi Pills on OP by KEGG analysis

2.6 核心靶點-通路網絡圖分析

構建核心靶點-通路網絡圖基于顯著富集的通路和調控這些通路的基因，如圖6所示。對前20條通路和81個與前20條通路有關系的基因根據連接節點的數目(degree)進行了分析，黃色正方形代表目標基因，V形代表前20條通路。從結果中得知，AKT1的degree值最大，是核心靶基因。其他幾個基因也有較大的degree，如MAPK1、MAPK8、JUN、IL6、VEGFA等，他們可能是濟生腎氣丸治療OP的核心靶點。

圖6 核心靶點-信號通路相互作用網絡圖Fig.6 Core target-signal pathway interaction network diagram

3 討論

網絡藥理學是多學科交叉互接，應用整體生物網絡的分析，揭曉藥物與靶點之間的相互關系，解釋中藥活性成分之間的協同作用機制[7]。把網絡藥理學的思想與方法融入進中藥藥理研究中，闡釋中藥治療疾病的作用機制，能更好的推動骨質疏松癥的防治[8]。骨質疏松癥的發病機制與脾、肝、腎三臟之間的關系緊密[9]。其中脾虛失其健運，氣血生化乏源致四肢不榮是骨質疏松癥發病的重要因素；肝失疏泄，藏血瀆職，筋脈失其所養是骨質疏松癥發病的重要病因；腎精虧虛、天癸衰竭、骨骼失養則是骨質疏松癥發病的直接原因[10]。濟生腎氣丸由“熟地黃”、“山茱萸”、“牡丹皮”、“山藥”、“茯苓”、“澤瀉”、“肉桂”、“附子”、“牛膝”、“車前子”十味藥組成，方中熟地黃具有滋補腎陰之效，佐以肉桂、附子助命門之火而溫陽化氣，有“陰中求陽”之意；山茱萸、山藥聯合運用可補肝益脾，生精化血；牛膝滋陰益腎，澤瀉、茯苓功可利水滲濕，可防地黃滋膩之弊；牡丹皮清肝泄熱，車前子清熱利濕，四藥功用為補中寓瀉[11]。

本研究發現濟生腎氣丸治療OP的主要核心活性成分為槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、漢黃芩素(Wogonin)等。Yuan等[12]研究發現槲皮素增加了絕經后骨質疏松大鼠的骨密度，改善了骨的生物力學性能，還能促進骨髓間充質干細胞的增殖和成骨分化。Konar等[13]通過研究證實了槲皮素對BMP-2的結構和構象有顯著影響，表明槲皮素是一種潛在的治療絕經后骨質疏松癥的治療方法。山柰酚通過促進成骨細胞形成來預防去卵巢誘導的大鼠骨質疏松癥，使大鼠骨髓間充質干細胞的礦化作用增強，ALP活性升高、Runx-2和Osterix表達水平升高、p-S6K表達水平升高、p-4E/BP1表達水平降低，與其促進成骨細胞分化的能力一致[14]。山柰酚能通過抑制脂肪生成、炎癥、氧化應激、破骨細胞自噬和成骨細胞凋亡，激活成骨細胞自噬，達到骨保護作用，因此對骨質疏松癥的預防和治療有潛在的效果[15]。漢黃芩素通過抑制NFATc1從細胞質向細胞核的轉運，從而抑制與破骨細胞分化相關基因的下調，且抑制了破骨細胞的分化，表明漢黃芩素是一種潛在的治療骨質疏松癥的藥物[16]。

本研究通過蛋白互作用網絡與核心靶點-通路圖的結果提示濟生腎氣丸作用于OP的關鍵靶點涉及AKT1、MAPK1、JUN、MAPK8、IL6、VEGFA等。Zhang等[17]研究發現AKT1(絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶)與成骨細胞分化、破骨細胞形成有著密切聯系，可作為骨質疏松癥的治療靶點。研究表明AKT1是成骨細胞中一個獨特的信號傳導媒介，它可以控制成骨細胞和破骨細胞的分化[18]。Zhang等[19]在基因網絡分析中發現AKT1等基因都與骨密度存在密切的聯系。MAPK8、MAPK1是MAP激酶家族的成員，參與多種細胞過程，如增殖、分化、轉錄調控和發育等。研究發現骨髓間充質干細胞衍生的外泌體通過MAPK促進成骨細胞增殖，從而改善骨質疏松癥[20]。MAPKs可以控制各種細胞活動，包括基因表達、分化、細胞存活和凋亡，特別是在調節炎癥和免疫反應中起重要作用，研究表明MAPKs在破骨細胞中的激活和對胞吐作用的抑制是糖尿病骨質疏松癥的主要原因[21]。此外，研究發現活化的MAPK在促進成骨細胞的生成、減少破骨細胞分化以及改善OP方面具有重要意義[22-23]。c-Jun氨基端激酶(其蛋白為JUN)與成骨細胞的增殖和破骨細胞的分化、成熟和功能有著密切的聯系，在維系骨形成和骨吸收之間的動態平衡中有著重要作用[24]。Ji等[25]探討IL-6(白細胞介素6)基因四種單核苷酸多態性與骨質疏松易感性的關系時發現rs1800796基因與IL-6的C等位基因rs2069849的相互作用均與增加骨質疏松癥風險有關。Lin等[26]發現白細胞介素6多效性的細胞因子對骨重建至關重要。VEGFA(血管內皮生長因子A)被認為同時支持血管生成和成骨細胞功能，這兩個過程是體內骨形成所必需條件之一，VEGFA還能以劑量依賴的方式促進體外成骨細胞的存活、分化和礦化[27]。

根據KEGG通路分析提示濟生腎氣丸治療OP相關通路涉及腫瘤壞死因子信號通路、白細胞介素17信號通路、AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路等。腫瘤壞死因子(TNF)具有脂質代謝、凝血、胰島素抵抗、內皮功能等作用，TNF可刺激破骨細胞的分化，抑制成骨細胞的祖細胞聚集。TNF還可促進RANKL的產生，并與RANKL協同促進破骨細胞分化作用，與RANKL誘導的信號轉導通路整合，促進破骨細胞吸收[28]。炎癥反應亦是絕經后骨質疏松癥(POP)重要的病理生理過程，有研究發現POP患者血清中白細胞介素17(IL-17)水平越高反而骨密度越低，進而提示IL-17可能通過影響骨密度來參與POP的發病過程，通過降低POP患者體內增加的IL-17水平可能對其治療及預后有重要的臨床意義[29]。AGE-RAGE信號通路存在于許多疾病中，晚期糖基化終產物(AGEs)與AGEs受體(RAGE)相互作用，對骨細胞代謝和功能改變有重要作用。一些糖尿病骨病患者的臨床結果，如骨密度降低、骨轉換標志物抑制和骨質量損害，可能是由于AGE-RAGE信號通路的影響[30]。AGE-RAGE的相互作用會導致氧化應激的產生，進而引發多種細胞的炎癥和凝血反應，加重骨質疏松癥等疾病的進展，結果表明抑制AGE-RAGE引起的氧化應激的產生可能是一個新的治療靶點[31]。流體剪切應力(FSS)可誘導內質網(ER)鈣快速釋放，產生鈣瞬變，在成骨細胞增殖和分化中起重要作用，此研究闡明了FSS誘導的成骨細胞增殖與鈣瞬變的大小有關，而鈣瞬變又進一步激活了能量代謝信號通路[32]。動脈粥樣硬化(Atherosclerosis)和骨質疏松癥是相互關聯的實體，具有相似的致病機制[33]。最近有研究[34]表明骨代謝的關鍵蛋白，如骨保護蛋白(osteoprotegerin，OPG)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)也參與血管粥樣硬化和鈣化。

綜上所述，濟生腎氣丸治療OP具有多靶點、多途徑、多通路的特點，也體現了中醫學的辨證論治與整體觀念，基于網絡藥理學分析藥物與疾病的相互關系能有效的揭示濟生腎氣丸治療OP的可能機制。濟生腎氣丸治療OP結果表明：濟生腎氣丸活性成分可能通過作用于AKT1、MAPK1、IL6、MAPK8、JUN、VEGFA等關鍵靶標基因，調控腫瘤壞死因子信號通路、白細胞介素17信號通路、AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路等發揮其臨床功效，達到治療OP的目的。由于本研究主要基于數據庫信息的提取，雖然使用多個數據庫進行綜合分析，但仍可能與濟生腎氣丸發揮作用的實際過程存在一定的區別，下一步需要通過動物模型實驗和細胞生物學實驗進行驗證。