人參皂苷Rh2通過OPG/RANKL信號通路介導對老年大鼠骨量流失的保護作用

朱恒杰 陳揚平 姚江凌

海南醫學院第一附屬醫院急診創傷科，海南 海口 570103

骨質疏松癥已經成為一個嚴重的醫學問題，它是一種以骨組織微結構退行性改變和骨量減少為特征的疾病，可導致骨質脆性增加，骨折發生率增加[1]。根據病因可分為原發性骨質疏松癥和繼發性骨質疏松癥，原發性骨質疏松癥包括老年性和絕經后骨質疏松癥，繼發性骨質疏松癥所占比例很小。去卵巢大鼠模型是目前最常用的絕經后骨質疏松動物模型。在年輕和老年大鼠與人類中，同樣的機制調控著骨量的增加和丟失[2]。骨質疏松癥最危險的結果是骨折，即使是輕微的創傷或日常活動也可能導致骨折，無論是在脊柱、髖部和前臂遠端這樣的常見部位也是如此[3-4]。目前，治療骨質疏松癥最常用的藥物如雙膦酸鹽、甲狀旁腺素片段、RANK配體抑制劑等。然而，這些藥物耐受性較差和長期不良反應的限制[5-6]。因此急需新的藥物來改善這類情況。人參具有多種潛在作用，包括免疫作用、抗癌作用、性功能增強作用等。但是，很少有研究評估其抗骨質疏松作用[7]。本研究觀察人參提取物人參皂苷Rh2對老年大鼠骨量流失的影響并探索可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗分組和治療

在本實驗中使用雌性SD大鼠(其中10只為3月齡大鼠記為(Con組)，10只為24個月齡老年大鼠使用生理鹽水治療記為(Mod組)，10只為24個月齡大鼠每天接受人參皂苷Rh2(購于浙江亞克藥業有限公司，每100 g粉末中含有16.2 g人參皂苷Rh2)給藥300 mg/(kg.d)，持續治療12周記為(Rszg組)。大鼠可以自由攝取實驗室提供標準的顆粒飲食和水。將實驗動物飼養在溫度23±2℃，恒定濕度(45%～50%)， 12 h/12 h暗光照循環的空調房間中。通過每周稱重大鼠并調整人參皂甙Rh2的劑量。治療12周后取出雙側股骨，用10%中性緩沖福爾馬林固定24 h，進行微型計算機斷層掃描檢查(Micro-CT)和生物力學檢測。將右股骨切片并在液氮中冷凍以用于Western印跡(WB)分析。

1.2 Micro-CT成像與組織形態學分析

左側股骨通過Micro-CT測量(μCT80，Sanco Medical，Brüttisellen，Switzerland)，并通過相關分析軟件(μCT80 Evaluation Program v6.51，Sanco Medical，Switzerland)進行評估。掃描后，選擇股骨遠端高于生長板2 mm的松質骨作為VOI，該VOI僅限于股骨內部區域，其中通過使用CT分析器軟件繪制自由形式等高線來提取小梁和皮質骨。使用標準化技術勾勒松質骨的微觀結構，通過多平面重組獲得三維(3D)圖像；以確定骨體積分數(BV/TV，%)、骨小梁厚度(Tb.Th，μm)，骨小梁數目(Tb.N，mm-1)、骨小梁間隙(Tb.Sp，μm) 和骨密度(BMD，mg/cm3)。

1.3 HE染色組織切片檢測

將每個標本縱向切成5 μm厚的切片，并選擇中心部分進行每個標本組織的分析。選擇股骨組織切片，并用蘇木精和曙紅(HE) (上海新宇生物技術有限公司)染色進行常規形態學分析。

1.4 生物力學評估

右側股骨(每組n=5)使用Instron 4302系統進行三點彎曲實驗評估。將股骨放在材料檢測機支架上，測試區域定義為股骨的最中央部分。以2 mm/min的速度施壓載荷直至骨折。通過連接的計算機監控骨折時的最大載荷(N)和彈性模量(mm2)的數據。

1.5 WB檢測

左側股骨在液氮中粉碎后，用IP裂解緩沖液從骨組織中提取總蛋白。用BCA蛋白試劑盒定量測定蛋白濃度。將蛋白與加載緩沖液混合，在100 ℃煮沸5 min，使其變性。用15 %SDS-PAGE分離50μg總蛋白，轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉1 h后，將膜分別與OPG、Runx2 和RANKL一抗在4 ℃孵育過夜，然后與辣根過氧化物偶聯的二抗在室溫下孵育1 h。用ECL試劑(美國Thermo Scientific)顯影印跡。使用GAPDH進行歸一化。用Image J軟件測量各蛋白條帶的總和密度。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 Micro-CT結果分析

股骨干骺端骨小梁三維重建圖像如圖1 A所示。股骨干骺端的微觀參數如圖1B～F所示。Mod組左側股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Con組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)。Rszg組左側股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于Mod組(P<0.05)，而Tb.Sp則明顯低于Mod組(P<0.05)。

圖1 三組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結果注： a Con， b Mod， c Rszg；與Con組相比，*P<0.05；與Mod組相比，#P<0.05。Fig.1 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of three groups of rats

2.2 股骨組織病理學

股骨干骺端骨小梁HE染色如圖2所示，Con組織顯示股骨干骺端骨小梁致密，骨小梁網狀結構正常。Mod組組織表現為疏松均勻的骨小梁變薄，導致骨小梁間隙變寬。Rszg組骨小梁數量和連接增加明顯，表現出明顯的結構恢復。

圖2 三組股骨的組織病理學注：A Con， B Mod，C Rszg；蘇木精-伊紅染色(10×)。Fig.2 Histopathology of femurs in the three groups

2.3 股骨的生物力學變化

股骨三點彎曲試驗表明，Con組的最大載荷和彈性模量均高于Mod組，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)，Rszg組的最大載荷和彈性模量均高于Mod組(P<0.05)。見圖3。

圖3 右股骨的三點彎曲試驗結果注：與Con組相比，*P<0.05；與Mod組相比，# P<0.05。Fig.3 Three-point bending test results of the right femur of rats

2.4 WB分析

和Con組比較，Mod組OPG和Runx2表達水平明顯下調，而RANKL表達水平明顯上調，差異有統計學意義(P<0.05)。和Mod組比較，Rszg組OPG和Runx2表達水平明顯上調，而RANKL表達水平顯著下調，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 使用WB檢測OPG、Runx2、RANKL和GAPDH的相對表達注：與Con組相比，*P<0.05；與Mod組相比，#P<0.05。Fig.4 Relative expression of OPG、Runx2、RANKL to GAPDH using Western blotting

3 討論

人參是世界上最受歡迎的草藥之一，人參皂甙Rh2是其主要成分之一。 據報道，在實驗模型中，人參皂甙Rh2具有多種生物活性，包括抗發炎、抗腫瘤和抗糖尿病[8]。 此外，人參皂甙Rh2抑制了骨碎屑的形成而沒有任何細胞毒性[9]。因此，人參皂苷Rh2生物活性物質可能對預防老年骨量流失有用。然而，人參皂苷Rh2對老年骨量流失作用和機制仍是未知的。基于上述數據，本研究的目的是評估人參皂甙Rh2對老年雌性SD大鼠骨骼的影響。

在本研究中，從實驗開始到治療第12周，老年大鼠股骨干骺端骨小梁微觀結構和骨密度發生顯著改變。人參皂甙Rh2的使用顯著增加了老年大鼠骨量和骨密度，股骨干骺端Micro-CT和HE切片觀察的結果已經清晰表明。在這項研究觀察到的人參皂甙Rh2的有益作用可能不僅是由于其促進成骨的效果，而且還因為其對骨吸收的抑制作用。此外，在2018年一項研究[10]中，有學者已經指出人參可以下調實驗動物模型中NF-κB刺激的炎癥反應，并通過抑制NF-κB介導的炎癥基因表達來抑制炎癥。破骨細胞的形成需要核因子κB(NF-κB)信號傳導。因此，抑制該信號分子可能會降低破骨細胞的增殖、分化和活性，并減慢骨吸收，這很好解釋了本研究中人參皂苷Rh2的骨保護作用的影像學和組織學切片觀察的結果。

由于骨強度直接影響到骨骼抗骨折能力，是骨密度和骨微觀結構外反映治療效果最直接指標[11]。本研究觀察人參皂苷Rh2對大鼠股骨骨強度的影響，發現老年大鼠的最大載荷和彈性模量較年輕大鼠顯著降低，而經過人參皂苷Rh2治療12周，最大載荷和彈性模量較Mod組顯著升高，這表明人參皂苷Rh2能改善老年大鼠股骨骨強度。骨骼穩態主要通過成骨細胞和破骨細胞的合作來維持[12]。骨保護素(OPG)是一種具有破骨細胞潛在抑制活性的蛋白，在成骨細胞/基質細胞中自然表達[13]。由成骨細胞/基質細胞產生的RANKL是可與RANK結合的跨膜配體。RANK和RANKL相互作用可以啟動基因表達和信號傳導級聯，從而導致破骨細胞前體細胞分化為成熟的破骨細胞。Runx2對于成骨細胞的發育和骨形成至關重要。作為轉錄因子Runt域家族的成員，Runx2結合特定的DNA序列來調節眾多基因的轉錄，從而控制成骨細胞從間充質干細胞向成骨細胞的發育和成熟[14]。這項研究的結果表明，人參皂甙Rh2可以調節OPG/RANKL比率并抑制破骨細胞的發生，同時促進Runx2表達。這些結果支持人參皂苷Rh2可以通過刺激OPG和Runx2表達和抑制RANKL表達來調節破骨細胞的分化和功能，這表明人參皂苷Rh2具有可以預防絕經后骨質疏松癥的可能機制。

本研究有其不足之處，首先研究模型限制了研究結果進一步推廣；其次劑量選取的原因只能證實本研究選取的劑量對老年骨骼流失保護作用，是否適合其他類型的骨質疏松癥就不得而知了；由于沒有進一步研究該藥物對細胞的影響，因此需要進一步進行體外研究驗證其對成骨細胞和破骨細胞的影響。

總之，人參皂苷Rh2治療對老年大鼠骨量流失起到保護作用，而這種效果可能通過介導OPG/RANKL信號通路和促進Runx2表達來實現的。