電針對缺血性腦卒中大鼠記憶功能及腦內突觸囊泡蛋白的影響*

石永光 ，徐 銀 ，喻緒恩 ，李廣大 ，董健健 ，張亮亮 ，韓永升 △

（1.安徽中醫藥大學， 安徽 合肥 230038；2.安徽中醫藥大學神經病學研究所附屬醫院，安徽 合肥 230061）

腦血管疾病（cerebrovascular disease，CVD）具有高發病率、高致殘率及高死亡率等特點，是中樞神經系統最常見的疾病之一，是導致人類因病致殘和死亡的主要原因，嚴重威脅人體健康及影響生活質量[1-2]。缺血性腦血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）即缺血性腦卒中在腦血管疾病中占有較大比例，大約80%的腦血管疾病為缺血性腦卒中[3]。隨著對缺血性腦卒中的研究及醫療技術的進步，該病的治療取得了很大的進展。目前，西醫針對缺血性腦血管病血管介入及溶栓的開展，部分患者得到了極好的救治，但仍存在大部分患者因錯過最佳治療時間窗，或取栓（溶栓）后腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI），進一步影響了預后。西醫治療腦卒中效果欠佳，特別是超過時間窗或存在CIRI的患者療效不確定，而針灸治療腦卒中療效確切，能促進神經功能康復[4-5]，現已成為腦卒中的常規治療手段。本實驗主要通過電針干預治療急性大腦中動脈缺血大鼠模型，研究其促進運動及記憶功能恢復的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇8周齡、體質量約250 g的雄性SD大鼠90只，飼養環境設定為濕度保持在50%左右的恒溫實驗室，并12 h光照及12 h黑暗日夜系統。大鼠可自由進食及取水，選用清潔級顆粒飼料，定時依照墊料清潔度更換墊料。SD大鼠購自濟南鵬悅試驗動物繁殖有限公司，批號：SCXX（魯）20190003。所需飼料、墊料均來源于安徽中醫藥大學實驗動物中心。適應性喂養1周后稱重，再進行造模等實驗操作。

1.2 試劑與儀器 試劑：10%水合氯醛、PBS、TBST、TTC（購于Sigma公司）、SYN一抗（購于美國abcam公司）。儀器：G6805型電針治療儀（蘇州醫療用品廠）、Barnes迷宮測試板及XR-XB108型巴恩斯迷宮視頻分析系統（上海欣軟）、JW-3021HR高速離心機。

1.3 造模與分組 將90只SD大鼠隨機分為模型組、電針組、假手術組，然后各大組再依據電針天數分為 7、14、21 d 3 小組。參照 Koizumi方法[6]，制備急性大腦中動脈缺血動物模型。常規消毒麻醉后，取左頸部正中切開皮膚，鈍性分離皮下組織，分別暴露左頸總、頸外動脈、頸內動脈、動脈，在頸外動脈遠端處結扎并剪一小切口，將提前制備好的線拴緩慢插入頸內動脈，插入深度約18 mm，遇阻停止插入線拴，線拴保留1 h后退出線拴，逐層縫合皮下組織及皮膚；電針組手術同模型組，假手術組手術步驟同模型組，但不置線栓。參照Zea Longa E等[7]進行評分，1～3分為造模成功，差額補充法保證每組最終SD大鼠的例數。

1.4 干預治療方法 電針組：依據華興邦[8]大鼠針灸穴位圖取“百會”“內關”“水溝”“三陰交”穴位，采用“醒腦開竅”針刺法進行電針。先用提插法直刺雙側“內關”1 min，再用雀啄法斜刺“水溝”1 min，其次提插法直刺“三陰交”1 min，最后刺“百會”1 min，“內關”“三陰交”“百會”均留針30 min。留針期間，用G6805電針儀刺激“內關”“三陰交”，電針儀設定為疏密波，電壓2～4 V、頻率1～20 Hz。首次電針在術后24 h進行，每日電針1次，連續電針6 d休息1 d。模型組及假手術組不予電針干預。

1.5 標本留取 各小組SD大鼠在做完行為學評估后進行標本留取，隨機取5只，10%水合氯醛麻醉，用組織剪剪開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，用注射器向心臟注入0.9%生理鹽水，至流出血水顏色變淡即停止注入，立即動作輕柔地剖顱取出完整大腦，用冰的0.9%生命鹽水盡量洗去血水，置于-80℃冰箱保存，待行Western blot檢測。同法取出剩余5只大鼠腦組織，然后放置于-20℃冰箱冷凍15 min，進行TTC染色。

1.6 指標觀察

1.6.1 行為學評分 分別在7、14、21 d對3組實驗大鼠進行神經功能評分[9]。①平衡木行走評分：快速無跌倒通過（1分）；通過大于1/2時跌倒（2分）；通過小于1/2時跌倒（3分）；僅能坐上平衡木（4分）；不能坐上平衡木（5分）。②轉棒上行走評分：能在轉棒上行走大于1 min（0分）；能在轉棒上行走小于1 min（1分）；轉動后掉下（2分）；轉動前即掉下（3分）。③網屏試驗評分：抓住網屏大于5 s且不滑落（0分）；抓住網屏大于5 s且有滑落未掉下（1分）；5 s內掉下（2分）；不能抓住網屏（3分）。

1.6.2 Barnes空間記憶實驗 Barnes迷宮是由測試板、監控系統及電腦數據分析系統組成。測試板為直徑1 m左右的圓形黑色板，周邊設有20個洞口，僅有1個洞口下放置底盒為隱藏區，其余為暴露區。每只SD大鼠訓練時將其放置隱藏區，讓其適應30 s，然后置于測試板中心，讓其自主尋找隱藏區。每次僅1只大鼠訓練240 s，每只SD大鼠連續訓練2次。連續6 d，第7天開始測試，連續測試2次，應用電腦數據分析系統分析數據，每只大鼠均取2次中的最優值。

1.6.3 TTC染色 冰凍好的SD大鼠腦組織變硬后行冠狀位切成2 mm的切片，將腦切片置于提前配置的2%的TTC液中，TTC液要完全覆蓋切片，15 min翻動一次切片，共染色30 min。梗死組織不著色，正常組織染成紅色。使用高清數碼相機照相，應用捷達JD801圖像分析軟件計算腦梗死體積。先計算出每片梗死面積V，再累加乘以每片厚度。梗死體積=每片微梗死面積之和（V1+……Vn）*2 mm，最后計算得出梗死體積。

1.6.4 Western blot法檢測SYN 剪取梗死區腦組織100～200 mg，裂解提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，切膠、轉模，NC膜孵育4 h，4℃孵育一抗過夜，孵育二抗室溫搖床震蕩1.5 h，顯影成像，Image J軟件進行條帶分析。

2 結果

2.1 神經行為功能評分 假手術組大鼠無神經功能缺損，電針組神經功能評分（平衡木實驗、轉棒實驗、網屏試驗）均較模型組降低（P＜0.05），3組神經功能評分中電針組在7 d與模型組比較，差異無統計學意義，而在14、21 d與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明電針治療可促進腦缺血后神經功能的恢復，見表1。

表1 各組大鼠神經行為功能評分比較（±s，n=10，分）

表1 各組大鼠神經行為功能評分比較（±s，n=10，分）

注：與假手術組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

神經功能評分項目 組別21 d平衡木 假手術組 1.20±0.42 4.60±0.52▲▲實驗 模型組 2.50±0.8▲▲4.20±0.75 2.90±0.99★★轉棒實驗 假手術組 0.40±0.52 0.30±0.48 0.40±0.52模型組 2.70±0.48▲▲ 2.10±0.57▲▲ 1.90±0.57▲▲電針組 2.40±0.52 1.60±0.49 1.20±0.63★網屏試驗 假手術組 0.50±0.53 0.40±0.52 0.50±0.53模型組 2.60±0.52▲▲ 2.00±0.67▲▲ 1.70±0.48▲▲電針組 2.30±0.67 1.50±0.50 0.90±0.57★★14 d 1.40±0.52 4.10±0.74▲▲電針組 1.50±0.53★★7 d 1.30±0.48

2.2 Barnes記憶實驗進入隱藏區的潛伏期評分 通過圖1、表2看出，假手術組大鼠進入隱藏區的潛伏期用時較短，模型組及電針組潛伏期較長，其中電針組較模型組潛伏期明顯縮短，在7、14、21 d均有顯著差異（P＜0.01）。且在電針組組內比較，隨著治療時間的延長潛伏期時間呈下降趨勢，有顯著差異（P＜0.01），見圖 1、表 2。

表2 各組大鼠不同時間點進入隱藏區的潛伏期時間（x± s，n=10，s）

2.3 TTC染色腦梗死體積 假手術組腦組織各冠狀位切面無梗死灶，而模型組及電針組的梗死區相應切面對比，電針組腦梗死體積與模型組相比在7、14、21 d均縮小。但在7 d時2組間差異無統計學意義，在14、21 d電針組與模型組差異有統計學意義（P＜0.01）。說明電針可促進腦缺血后梗死區的縮小，見圖2、表 3。

表3 各組大鼠不同時間點腦梗死體積（±s，n=10，mm3）

表3 各組大鼠不同時間點腦梗死體積（±s，n=10，mm3）

注：與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01

腦梗死體積組別7 d 14 d 21 d假手術組 0 0 0模型組 36.89±1.67 29.50±2.91 20.59±3.38電針組 35.40±1.87 22.80±1.46★★ 13.28±2.75★★

2.4 SYN的蛋白表達 假手術組SYN弱表達，模型組及電針組表達上調，電針組表達較模型組明顯增強，在7、14、21 d電針組表達均高于模型組。定量結果顯示，與模型組比較，電針組在7、14、21 d SYN表達均顯著增加（P＜0.01）；模型組組內比較，隨著觀察時間延長，SYN蛋白表達逐步增加，第21天與第7天比較，SYN表達顯著增加（P＜0.01）；電針組組內比較，隨著觀察時間延長，SYN蛋白表達同樣呈上升趨勢，第21天與第7天相比，SYN表達顯著增加（P＜0.01），見圖3。

3 討論

腦卒中即缺血性腦血管病，分為出血性及缺血性腦中風兩種類型，多以猝然昏仆、言語不能、口舌歪斜、半身不遂等為主癥，好發于中老年人。針灸治療腦中風療效確切，具有獨特優勢，能促進腦卒中后神經功能缺損癥狀的恢復，因其經濟、方便，目前在腦卒中治療中應用較為廣泛[10-11]。

目前針刺干預缺血性腦卒中的療效，不但有循證醫學證據，亦有動物實驗理論研究支持。王立童等[12]通過采用子午流注針刺法對78例缺血性腦卒中患者的手功能障礙干預治療，發現針刺可改善患者神經功能障礙，提高生活質量，且配合康復訓練，更能改善神經運動功能。鄭愛軍等[13]通過對比針刺干預64例腦卒中患者，發現針刺可避免患肢的肌張力增高，利于患肢的肌力恢復，進而促進神經功能恢復，尤其早期治療療效更加確切。黃倩茹等[14]經造模新生缺血缺氧SD仔鼠，分別給予電針干預，對比發現電針可增加新生仔鼠的體重，并能促進其神經功能發育。

關于電針可促進缺血性腦卒中記憶功能的改善及其機制研究亦有較多報道[15]。蔣持怡等[16]通過對海馬區 IL-1β、IL-6 及 p-STAT3、p-JAK2 等蛋白的檢測，進一步從分子生物學水平證實電針可促進認知功能的改善，減輕海馬神經元的損傷。梁慧英等[17]通過電針干預“百會”及“足三里”發現可促進血管性癡呆大鼠記憶功能的改善。突觸囊泡蛋白（SYN）在缺血性腦卒中神經功能缺損及記憶功能改善中均有重要作用[18-20]。趙宇紅等[21]對認知功能障礙小鼠研究發現，芹黃素通過上調SYN的表達，促進突觸修復及再生，從而改善其學習記憶功能。高海玲等[22]研究發現SYN表達下降可導致突觸可塑性下降，進而影響學習記憶能力。

本實驗研究結果表明，電針干預治療后，電針組SD大鼠神經功能評分在7 d時即有所改善，而在14 d及21 d時較模型組對比改善明顯。在Barnes記憶實驗中，電針后SD大鼠進入隱藏區潛伏期時間較模型組明顯縮短，說明電針可改善缺血后大鼠運動及記憶功能。同時TTC染色圖片及數據分析均提示電針后腦梗死體積較模型組明顯縮小。通過檢測腦梗死區SYN的表達，發現假手術組或正常腦組織中的SYN表達較弱，而缺血后SYN的表達均有所上調，但對比發現電針組較模型組SYN的表達明顯上調，且在一定療程時間內隨電針時間的延長而增強。

綜上所述，電針不但可改善缺血性腦卒中神經功能缺損癥狀，還可進一步改善其空間記憶功能，其機制可能與電針通過上調SYN的表達有關。