溫陽通絡方抗膠原誘導性關節炎小鼠滑膜新生血管形成的機制研究*

殷世云，吳晶金

（云南省中醫醫院，云南 昆明 650021）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性、對稱性關節炎為主要表現的全身炎性免疫病[1]。我國患病率約為0.2%～0.4%[2]，具有較高的致殘率，如不及早合理治療，3年內關節破壞可達70%。在歐美國家，RA年經濟負擔超過400億歐元，因此開展干預RA的研究具有重要戰略意義。類風濕關節炎的重要病理特征就是滑膜血管翳，新生血管形成在RA進程中扮演重要角色，被認為是疾病由急性向慢性轉換的關鍵環節。本研究旨在以溫陽通絡方為研究載體，探討其干預RA新生血管形成的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性 DBA/1小鼠90只，8周齡，體質量（18±3）g，購于北京維通利華實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（京）：2016-0011。飼養于云南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室SPF級動物房。實驗前先適應性喂養7 d，自由攝食攝水，動物房溫度維持在22～24℃，濕度維持在65%～70%。

1.2 藥品 牛II型膠原（C II）購自sigma公司；完全弗氏佐劑（CFA）購自BD公司；溫陽通絡方（主要由附片、桂枝、麻黃、薏苡仁、川芎、五加皮、赤芍等10余味中藥組成），由本院成藥房提供。甲氨蝶呤片，通化茂祥制藥有限公司（批號：H22022674）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 按隨機數字表法將實驗動物隨機分為甲氨蝶呤組、模型組、空白對照組、溫陽通絡方高、中、低劑量組，每組5只小鼠。

1.3.2 動物造模 空白對照組小鼠不做處理，其余小鼠均進行造模。實驗前1 d配制2 mg/mL的牛II型膠原溶液，置于4℃冷藏過夜。冰浴下與 CFA按照1∶1比例充分混勻，制成乳劑。固定小鼠后，在距鼠尾根部 1 cm處以每只100 μL注射。

1.3.3 給藥方法 從致炎第21天開始給藥干預，溫陽通絡方高、中、低劑量組分別以 8.0、4.0、2.0 g/kg溫陽通絡方水溶液每天灌胃，甲氨蝶呤組按10 mg/kg每周給予甲氨蝶呤水溶液灌胃1次；模型組與空白對照組按10 mL/kg每天給予生理鹽水灌胃。實驗期間均予SPF級普通飼料。第48天末次灌胃后禁食水，第49天脫臼處死，滑膜組織備測。

1.3.4 滑膜組織的收集 小鼠處死后，仰位固定，置于冰上操作，離斷四肢，用冷生理鹽水沖洗干凈后，沿踝關節上方剪下整個關節囊，一部分常規脫鈣包埋，切片備用；一部分新鮮凍存于超低溫冰箱。

1.3.5 HE染色 石蠟切片進行常規脫蠟、水化：二甲苯I 10 min→二甲苯II 10 min→無水乙醇10 min→95%乙醇5 min→90%乙醇5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min→蒸餾水I 5 min→蒸餾水II 5 min。蒸餾水洗滌5 min。蘇木素染色16 min，洗去浮色，1%鹽酸酒精分化2 s（濃鹽酸1 mL加入99 mL的75%無水乙醇中配制）。自來水返藍。伊紅染色10 min，自來水終止顯色。梯度酒精脫水10 min，二甲苯透明30 min，中性樹膠封片，普通光學顯微鏡下拍照觀察。

1.3.6 滑膜組織的免疫組化檢測 對各組實驗動物滑膜組織石蠟標本行病理學常規染色，另取切片做免疫組化檢測。取各組標本常規脫蠟、水化，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次，浸入檸檬酸鹽緩沖液中，微波加熱至沸騰，中檔微波處理10 min，自然泠卻，用0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次。3%過氧化氫封閉，避光，室溫孵育30 min，0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次。5%羊血清室溫封閉1 h。去除多余的封閉液，加一抗稀釋液，4℃冰箱過夜。次日用0.01 mol/L PBST漂洗 5 min×4次。滴加 PV9000試劑 I，37℃孵育 30 min，0.01 M PBST漂洗5 min×3次，滴加PV9000試劑 II，37 ℃孵育 30 min，0.01 mol/L PBST 漂 5 min×4次；滴加DAB顯色液，室溫避光孵育5 min。蒸餾水沖洗，終止顯色。蘇木素復染2 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每組于高倍鏡下隨機選取6個視野拍照。用HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統分析各組小鼠滑膜組織Ang-2、VEGF表達。

1.3.7 滑膜組織Western blot檢測 取各組動物滑膜組織迅速稱重，每100 mg樣本加入預冷的8倍體積蛋白裂解液RIPA（含蛋白酶抑制劑：0.4 mM PMSF，1 mM Iodo，1 μM Pepstatin A）勻漿 30 min。提取液 4℃下12 000 r/min離心30 min后取上清，BCA法蛋白定量；PBS調至等體積，加5×SDS上樣緩沖液，沸水浴5 min；SDS-PAGE凝膠電泳，每孔上樣 20 μg，配膠，將膜于轉移液（含甲醇15%）中平衡10 min，80 V轉膜120 min后將膜取出，置于含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h。取出膜，對應一抗1∶1 000稀釋，4℃過夜；TBST洗3次，每次5 min；熒光二抗1∶10 000稀釋，室溫結合1 h；分別用TBST和PBS各洗3次，每次10 min。使用ODYSSEY紅外雙色激光成像系統對Ang-2、VEGF相對表達量進行分析，相關抗體購自美國BD公司。

1.4 數據處理 采用IBM SPSS Statistics 25.0統計軟件包進行數據處理，采用均數±標準差（±s）進行統計描述，組間數據比較采用方差分析（ANOVA）。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 溫陽通絡方對DBA/1小鼠及踝關節腫脹度的影響 造模前（0 d）、造模35 d，各組DBA/1小鼠足趾容積差異無統計學意義；造模48 d，各組足趾容積與空白對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。空白組、甲氨蝶呤組、溫陽通絡方低、中、高劑量組與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。空白組、模型組、溫陽通絡方低、中劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），溫陽通絡高劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 溫陽通絡方對CIA小鼠踝關節腫脹度的影響（±s，n=5）

表1 溫陽通絡方對CIA小鼠踝關節腫脹度的影響（±s，n=5）

注：與空白對照組同期比較，**P＜0.01；與模型組同期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與甲氨蝶呤組同期比較，▲▲P＜0.01。

組別空白對照組模型組146.20±4.21 149.60±4.83 153.80±3.42△△▲▲-156.00±5.79 158.00±6.82 352.40±6.73**▲▲甲氨蝶呤組 10 mg/kg 156.60±10.26 158.00±9.35 210.20±6.06**△△劑量 0 d 35 d 48 d-溫陽通絡方低劑量組 2.0 g/kg 155.00±3.93 157.40±2.07 323.80±43.75**△▲▲溫陽通絡方中劑量組 4.0 g/kg 148.80±10.71 151.60±11.28 255.20±21.37**△△▲▲溫陽通絡方高劑量組 8.0 g/kg 162.00±9.67 164.60±9.04 194.60±15.90**△△

2.2 溫陽通絡方對DBA/1小鼠滑膜組織炎癥的影響模型組滑膜組織HE染色提示有大量淋巴細胞浸潤及滑膜細胞增生；甲氨蝶呤組、溫陽通絡方高、中、低劑量組僅有少量淋巴細胞，未見明顯滑膜細胞增生，見圖1。

2.3 溫陽通絡方對DBA/1小鼠滑膜新生血管的影響免疫組化DAB染色，陽性反應呈棕黃色，模型組DBA/1小鼠滑膜組織中有大量Ang-2蛋白表達，甲氨蝶呤組、溫陽通絡方高、中、低劑量組中Ang-2蛋白表達水平明顯減少（P＜0.01），見圖2。

2.4 溫陽通絡方對DBA/1小鼠滑膜新生血管的影響免疫組化DAB染色，陽性反應呈棕黃色，模型組DBA/1小鼠滑膜組織中有大量VEGF蛋白表達，甲氨蝶呤組、溫陽通絡方高、中、低劑量組中VEGF蛋白表達水平明顯減少（P＜0.01），見圖 3。

2.5 溫陽通絡方對小鼠滑膜組織Ang-2、VEGF蛋白表達水平的影響 空白組、模型組、甲氨蝶呤組、溫陽通絡方高、中、低劑量組Ang-2、VEGF蛋白表達水平較模型組明顯降低，見圖4。

3 討論

溫陽通絡方是云南省名老中醫吳生元教授基于類風濕關節炎“陽虛絡痹”理論總結出的效驗方，已開發為院內制劑在中醫醫療集團50余家單位使用10余年，該方主要由附片、桂枝、麻黃、薏苡仁、川芎、五加皮、赤芍等10余味中藥組成，具有溫經通絡、散寒止痛之功，主治類風濕關節炎寒濕痹阻或風寒濕痹證。《中藏經》有：“陽者生之本，陰者死之基，陰宜長損，陽宜長益，順陽者生，逆陽者死”“陽化氣，陰成形”，陽氣周流，自然百病不作。陽衰陰長，風寒濕乘虛侵襲，具體表現在有形陰邪積聚——即大量滑膜新生血管形成。因此，陽虛邪乘，絡脈痹阻可能是滑膜新生血管形成的病機所在。前期臨床研究顯示，溫陽通絡方能改善RA患者證候積分及 DAS28、CDAI、SDAI等評分[3-6]，總有效率93.57%；實驗研究顯示其具有抗炎、鎮痛、調節免疫等作用[7-12]。

RA滑膜血管翳富集大量炎癥細胞及因子，同時也阻斷了關節軟骨營養吸收，在關節病變的發生發展中發揮重要作用。因此，抗滑膜新生血管形成可能是RA治療的新思路[13-16]。其他學者研究發現RA滑膜纖維母細胞以及吞噬樣細胞能夠較高水平的表達VEGF[17-20]，該因子是滑膜血管翳形成過程中的重要調節因子，而Ang-2對血管新生具有雙重作用，當滑膜中VEGF含量豐富時，Ang-2抑制Tie-2受體磷酸化，促進血管的新生和增生[21-22]。

本次研究提示溫陽通絡方能抑制膠原誘導性關節炎小鼠滑膜新生血管形成，其作用可能與下調滑膜組織Ang-2、VEGF蛋白表達水平有關，進而減輕血管翳形成，有關作用機制還需進一步深入研究。