右美托咪定對(duì)體外循環(huán)手術(shù)患兒外周血中性粒細(xì)胞凋亡和NF-κB活性的影響

郭瓊梅，劉秀葉，王 莉，周曉輝，魏硯硯，毛瑞芬

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科，河北 石家莊 050031)

心臟直視手術(shù)中體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass,CPB)的建立導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生的炎性因子不僅加重心肌細(xì)胞的損傷[1]，還造成了除心臟外其他組織細(xì)胞的損傷，如術(shù)后的肺功能減退等[2]。中性粒細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，作為機(jī)體防御性反應(yīng)的重要標(biāo)志物被大量激活，引起呼吸爆發(fā)和全身炎癥反應(yīng)綜合征。中性粒細(xì)胞的凋亡與清除是限制炎癥反應(yīng)、炎癥消散的重要方式，抑制其凋亡可以加重、發(fā)展炎癥反應(yīng)。研究證實(shí)，體外循環(huán)過程中外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量增多，凋亡延遲和減少，導(dǎo)致血漿促炎癥因子水平升高，其嚴(yán)重程度與體外循環(huán)時(shí)間及主動(dòng)脈阻斷時(shí)間相關(guān)[3]。中性粒細(xì)胞的蛋白表型與嬰幼兒體外循環(huán)后炎癥反應(yīng)結(jié)果相關(guān)[4]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的激活在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抑制心肌NF-κB信號(hào)通路的激活可以減輕法洛四聯(lián)癥患兒體外循環(huán)后的全身炎癥反應(yīng)[5]，不同劑量的右美托咪定可以減輕體外循環(huán)心內(nèi)手術(shù)患兒的全身炎癥反應(yīng)[6]。右美托咪定減輕體外循環(huán)患兒圍術(shù)期炎癥反應(yīng)的作用是否與抑制中性粒細(xì)胞NF-κB活性、減輕中性粒細(xì)胞的凋亡抑制和延遲有關(guān)尚不清楚。本研究擬評(píng)價(jià)右美托咪定對(duì)體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)患兒外周血中性粒細(xì)胞凋亡和NF-κB活性的影響，進(jìn)一步探討右美托咪定減輕炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年10月—2018年3月在河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院擇期CPB下行室間隔缺損修補(bǔ)術(shù)患兒60例，美國麻醉醫(yī)師協(xié)會(huì)(American Society of Anesthesiologists，ASA)分級(jí)Ⅱ或Ⅲ級(jí)。無近期急性感染史，肝腎功能未見異常，無重度貧血及近期使用皮質(zhì)激素治療史。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為2組(n=30)：對(duì)照組(C組)和右美托咪定組(D組)。2組患兒性別、年齡、體重、主動(dòng)脈阻斷時(shí)間和連續(xù)性血液凈化時(shí)間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般情況各指標(biāo)的比較Table 1 Comparison of general data between two groups

本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意并簽署知情同意書。

1.2麻醉方法 入室前30 min肌肉注射東莨菪堿0.01 mg/kg。肌肉注射氯胺酮4～6 mg/kg后入室，監(jiān)測(cè)血壓、心率和血氧飽和度，開放外周靜脈通路，行橈動(dòng)脈穿刺置管，持續(xù)監(jiān)測(cè)MAP。麻醉誘導(dǎo)：靜脈注射咪唑安定0.15 mg/kg，舒芬太尼1 μg/kg，依托咪酯0.3 mg/kg，羅庫溴銨0.6 mg/kg誘導(dǎo)，氣管插管后行機(jī)械通氣，氧流量2 L/min，潮氣量10～12 mL/kg，吸呼比1∶2，維持PETCO235～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。行右頸內(nèi)靜脈穿刺置管。麻醉維持：間斷靜脈注射舒芬太尼0.5～1 μg/kg、羅庫溴銨0.3～0.6 mg/kg，丙泊酚4～6 mg·kg-1·min-1持續(xù)輸注。CPB采用WEL-1000人工心肺機(jī)(天津匯康醫(yī)用設(shè)備有限公司)和ODMO-100型膜式氧合器(西安岱岱生物醫(yī)學(xué)工程有限責(zé)任公司)。羥乙基淀粉130/0.4、壓積紅細(xì)胞、冷凍血漿等預(yù)充，晶膠比0.4～0.6∶1。動(dòng)脈流量80～120 mL·kg-1·min-1，術(shù)中維持平均動(dòng)脈壓 40～60 mmHg。術(shù)畢帶氣管導(dǎo)管入ICU，待患兒蘇醒、肌力恢復(fù)、血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定后拔除氣管導(dǎo)管，術(shù)后進(jìn)行靜脈鎮(zhèn)痛，配方為舒芬太尼2 μg/kg加生理鹽水稀釋至100 mL，輸注速率2 mL/h，維持VAS評(píng)分≤3分。

1.3標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 麻醉誘導(dǎo)后D組給予初始劑量0.5 μg/kg的鹽酸右美托咪定注射液(批號(hào)：20131101，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司)(給藥時(shí)間>10 min)，繼之以0.4 μg·kg-1·h-1的速率維持至術(shù)畢，C組給予等容量生理鹽水。于CPB開始前(T0)、CPB開始后30 min(T1)、CPB停止后30 min(T2)、CPB停止后4 h(T3)和CPB停止后24 h(T4)采集橈動(dòng)脈血5 mL，其中3 mL肝素抗凝后，3 000 r/min離心10 min，取上層血漿，-20 ℃保存。采用Percoll密度梯度離心法分離中性粒細(xì)胞，瑞氏染色檢驗(yàn)分離細(xì)胞的純度，臺(tái)盼蘭檢驗(yàn)細(xì)胞活性。用流式細(xì)胞儀觀測(cè)中性粒細(xì)胞凋亡率和Caspase-3的表達(dá)。采用細(xì)胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)提取中性粒細(xì)胞核蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試法(Sandwich ELISA)測(cè)定NF-κB活性，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值，反映NF-κB的活性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料分別采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)和重復(fù)測(cè)量的方差分析，兩變量間的相互關(guān)系用直線相關(guān)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2組患兒中性粒細(xì)胞NF-κB活性在T1～4均較T0時(shí)升高(P<0.05)，D組在T1～4各時(shí)間點(diǎn)均低于C組，2組在組間、時(shí)點(diǎn)間及組間·時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組患兒中性粒細(xì)胞凋亡率和Caspase-3的表達(dá)從T0到T2逐漸降低，T3、T4時(shí)升高，但均較T0時(shí)降低，D組在T1～4各時(shí)間點(diǎn)均高于C組，2組在組間、時(shí)點(diǎn)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中性粒細(xì)胞凋亡率與NF-κB活性呈負(fù)相關(guān)(C組：r=-0.606，P<0.05；D組：r=-0.691，P<0.05)。見表2。

表2 2組中性粒細(xì)胞凋亡率、NF-κB活性和Caspase-3表達(dá)的比較Table 2 Comparison of apoptosis rate of polymorphonuclear,NF-κB activity and express of caspase-3 between two groups

3 討 論

中性粒細(xì)胞的大量激活是各種原因?qū)е氯硌装Y反應(yīng)和嚴(yán)重的炎癥性疾病進(jìn)展過程的重要環(huán)節(jié)。中性粒細(xì)胞被激活后可釋放蛋白水解酶和大量的氧自由基及各種炎癥介質(zhì)，造成正常組織細(xì)胞的損傷。作為終末分化細(xì)胞的中性粒細(xì)胞凋亡被抑制時(shí)，各種炎癥介質(zhì)和毒性物質(zhì)釋放增多，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇[7-9]。體外循環(huán)過程中的各種應(yīng)激因素導(dǎo)致中性粒細(xì)胞被大量激活，引起的全身炎癥反應(yīng)與中性粒細(xì)胞凋亡延遲相關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，隨著CPB的進(jìn)行，中性粒細(xì)胞凋亡率降低，在CPB停止后的30 min達(dá)最低。

NF-κB是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是細(xì)胞凋亡過程中重要的調(diào)節(jié)因素。NF-κB的活化是中性粒細(xì)胞凋亡抑制的重要機(jī)制之一，在各種急性炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。一些感染性疾病中NF-κB的活化導(dǎo)致中性粒細(xì)胞凋亡延遲，造成擴(kuò)散機(jī)體組織功能的損傷[10]。NF-κB活化抑制中性粒細(xì)胞凋亡的機(jī)制包括NF-κB活化促進(jìn)IL-8、IL-1β和TNF-α等炎性因子的釋放及上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)線粒體途徑抑制中性粒細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞表面死亡受體的表達(dá)，抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)等，從而抑制中性粒細(xì)胞的凋亡[9,11-12]。采用間充質(zhì)干細(xì)胞治療或其他藥物抑制NF-κB活化，改善炎癥反應(yīng)中性粒細(xì)胞凋亡被抑制的狀態(tài)，減輕脂多糖和內(nèi)毒素所致的急性肺損傷[13-14]。本研究結(jié)果顯示，隨著CPB的進(jìn)行，2組患兒NF-κB活性升高，中性粒細(xì)胞凋亡率降低，Caspase-3的表達(dá)降低，在CPB停止后30min時(shí)達(dá)最低值，且中性粒細(xì)胞凋亡率與NF-κB活性呈負(fù)相關(guān)，說明在體外循環(huán)過程中外周血中性粒細(xì)胞NF-κB的活化可能與中性粒細(xì)胞的凋亡減少和延遲有關(guān)。

右美托咪定作為全身麻醉的輔助用藥，有利于術(shù)中血流動(dòng)力學(xué)的平穩(wěn)，并通過抑制圍術(shù)期應(yīng)激反應(yīng)和血漿炎癥因子的釋放，減輕體外循環(huán)手術(shù)過程中及術(shù)后的全身炎癥反應(yīng)及缺血再灌注損傷，保護(hù)心臟及其他重要臟器的功能[15-16]，研究表明這些作用的機(jī)制可能與抑制外周血單核細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)[17-18]。右美托咪定通過激活α2腎上腺素能受體抑制中性粒細(xì)胞趨化因子的產(chǎn)生及白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用[19]，減少中性粒細(xì)胞在組織器官的集聚，減少TNF-α和IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)，在圍術(shù)期發(fā)揮器官保護(hù)作用[20]。右美托咪定可以減少大腸桿菌刺激產(chǎn)生的中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)作用，這對(duì)減輕應(yīng)激狀態(tài)下的全身炎癥反應(yīng)綜合征具有積極意義。同時(shí)研究證實(shí)，右美托咪定在各種應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)不同臟器的保護(hù)功能與抑制NF-κB信號(hào)通路的作用有關(guān)[21-23]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，右美托咪定組在CPB過程及停止后的各時(shí)間點(diǎn)中性粒細(xì)胞NF-κB活性降低，T2、T3時(shí)中性粒細(xì)胞細(xì)胞凋亡率明顯升高，Caspase-3的表達(dá)升高。Caspase-3是細(xì)胞凋亡死亡受體途徑和線粒體途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最終的共同通路，說明右美托咪定減輕了體外循環(huán)的中性粒細(xì)胞凋亡抑制，其可能與抑制NF-κB的活性有關(guān)。

綜上所述，NF-κB活性的抑制參與了右美托咪定減輕體外循環(huán)手術(shù)患兒外周血中性粒細(xì)胞凋亡抑制的過程，可能是其減輕體外循環(huán)手術(shù)患兒圍術(shù)期炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制之一。